酶类自由基清除剂

子任务二　酶类自由基清除剂

一、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)

英国人Mann等人于1938年首次从小牛血液中分离出一种含铜的蓝绿色蛋白质，但没有发现这种蛋白质的生理活性。1969年Mccwrd及Fridovich发现了该酶的歧化反应，并首次把这种酶蛋白命名为超氧化物歧化酶，英文简称为SOD。

超氧化物歧化酶(SOD)是目前研究最深入、应用最广泛的一种酶类自由基清除剂，是一种能够催化超氧化物通过歧化反应转化为氧气和过氧化氢的酶。它广泛存在于各类植物、动物、微生物中，是一种重要的抗氧化剂，保护暴露于氧气中的细胞。研究表明，SOD在生物界的分布极为广泛，几乎所有靠氧呼吸的生物体内，包括细菌、真菌、高等植物、高等动物和人体中都有它的存在。

(一)超氧化物歧化酶的分类及生理功能

1.超氧化物歧化酶的分类

SOD是一类含金属的酶，按其所含金属辅基的不同，可分为含铜锌SOD(Cu·Zn－SOD)、含锰SOD(Mn－SOD)和含铁SOD(Fe－SOD) 3种。

含铜锌金属辅基的Cu·Zn－SOD是一种最为常见的酶，呈蓝绿色，主要存在于真核细胞质和高等植物的叶绿体基质及线粒体内膜间隙中。在牛肝、猪肝、牛心、动物血液及植物的叶、果实等动植物组织中均有存在，是目前应用最广泛的一类酶。

Mn－SOD呈紫红色，主要存在于真核细胞以及线粒体的基质中，一些真核藻类甚至高等植物如银杏、柠檬、番茄等组织内也有存在。

Fe－SOD呈黄褐色，主要存在于原核细胞及少数高等植物中，在高等植物中一般仅存在于叶绿体而不存在于线粒体中。三种酶都可催化超氧阴离子(O^－2·)歧化生成H₂ O₂和O₂，但其性质有所不同，其中Cu·Zn－SOD与其他两种SOD差别较大，而Mn－SOD与Fe－SOD之间差别较小。

2.超氧化物歧化酶的主要理化特性

SOD属酸性蛋白酶，对蛋白水解酶、pH和热等较稳定。SOD又属于金属酶，其性质不仅取决于蛋白质，还取决于结合到活性部位的金属离子。SOD是生物体内防御氧化损伤的一种十分重要的金属酶，对氧自由基有强烈清除作用，特别对于超氧阴离子(O^－2·)，SOD可将其催化歧化而生成H₂O₂和O₂，故SOD又称为清除超氧阴离子自由基的特异酶。

3.超氧化物歧化酶的生理功能

(1)延缓衰老

衰老自由基学说认为衰老是来自机体正常代谢过程中产生过量的自由基对机体损害的结果。当机体衰老时，体内各式各样的自由基生成增多，自由基作为人体垃圾，是人体重要的内毒素之一。由于超氧化物歧化酶能够清除自由基，因而具有延缓衰老的作用。

(2)治疗自身免疫性疾病

超氧化物歧化酶对各类自身免疫性疾病都有一定的疗效，如红斑狼疮、关节炎、风湿性关节炎、老年退化性疾病等，都有较好的疗效。

(3)与放射治疗结合治疗癌症

超氧化物歧化酶还可以用来治疗由于放射治疗和放射事故引起的放射病和放射损伤。放射治疗既能杀死癌细胞，又会杀死正常组织细胞，如果在放射治疗时提高正常组织中的SOD含量以清除放射线诱发产生的大量的O^－2·，就可有效地抑制放射线对正常组织的损伤。

(4)消除肌肉疲劳

在军事、体育和救灾等超负荷大量运动量过程中，机体中部分组织细胞(特别是肌肉部位)会出现暂时性缺血及重灌流现象，引起缺血后重灌流损伤，加上大量乳酸的作用，导致了肌肉的疲劳与损伤。这时，给肌肉注射SOD可有效地解除疲劳与损伤。若在运动前给予SOD，则可保护肌肉，避免出现疲劳和损伤。

(5)提高人体的抵抗力

SOD能提高人体的抵抗力，包括提高人体对自由基侵害而诱发疾病的抵抗力，如对炎症、肺气肿、白内障、自身免疫性疾病、肿瘤等疾病的抵抗力。同时，SOD能提高人体对自由基诱发因子损害的抵抗力，如烟雾、辐射、有毒化学药品和有毒医药等的损害，增强机体对外界环境的适应力。

(二)超氧化物歧化酶的制备工艺

超氧化物歧化酶的制备工艺是依据酶蛋白质的性质而设计的，其方法也是常用的蛋白质分离方法，如热变性法、等电点沉淀法、盐析法、有机溶剂沉淀法、超滤法、层析法等，或者几种方法的结合使用。

1.制备超氧化物歧化酶的原料

制备超氧化物歧化酶的原料很多，主要有以下几类:

(1)动物主要有牛血、猪血、马血、鸭血、猪肝、牛乳、蛋黄等。

(2)植物包括刺梨、大蒜、冬菇、玉米、白菜、大豆、花生等。

(3)微生物如酵母菌等。

2.有机溶剂沉淀法制备超氧化物歧化酶

(1)原理

向蛋白质溶液中加入弱极性的有机溶剂如丙酮，可改变溶液的介电常数，使不同种类蛋白质的溶解度产生不同程度降低，还可进行蛋白质的纯化。当丙酮加入量达到1.0(V/V)时，SOD比活最高，再加入丙酮将导致SOD活力急剧下降。

(2)材料、试剂与仪器

材料、试剂:大蒜、磷酸氢二钾、硫酸铜、酒石酸钾钠、丙酮、标准蛋白(牛血清蛋白)。

仪器:恒温水浴锅、pH数字酸度计、高速冷冻离心机、冰箱、透析袋、冷冻干燥机等。

(3)工艺流程

对于不同原料，SOD的提取工艺也有所不同，其基本工艺流程如下:

(4)工艺要点

①SOD粗浸提:将大蒜研磨成蒜泥，加入3倍体积(mL/mg)的磷酸缓冲液，浸泡30～45min，用6层纱布抽滤，反复共3次，收集3次抽滤所得滤液，测得粗酶液。

②热变性:粗酶液在60℃的恒温水浴锅中保持20min进行热变性。

③高速冷冻离心:离心是在4℃、12 000rpm的条件下进行。

④调整pH、高速冷冻离心:用磷酸调整溶液的pH至3.5，然后在4℃、12 000rpm的条件下离心。

⑤丙酮沉淀、离心:在离心液中加入丙酮的量为1.0 v/v，4℃、12 000rpm离心，去除大部分杂蛋白。

⑥溶解沉淀、透析、冷冻干燥:在所得上清液中加入1.2～1.4 v/v的丙酮使SOD全部沉淀下来;将沉淀溶解在少量的缓冲液中，在4℃环境中透析10h。将透析过的样品进行冷冻干燥，即得成品。

大蒜中SOD的含量比其他植物相对较高，从大蒜中提取SOD，成本低廉。

3.盐析法制备超氧化物歧化酶

(1)原理

当溶液中盐浓度增高到一定数值时，使水活度降低，导致蛋白质分子表面电荷逐渐被中和，水化膜逐渐被破坏，最终引起蛋白质分子间相互聚集并从溶液中析出。硫酸铵因价廉、溶解度大，且能使蛋白质的性质保持稳定而成为最常用的盐析剂。选择一定浓度范围的盐浓度(如1%～25%饱和度硫酸铵)，使部分杂质呈“盐析”(沉淀)状态，有效成分呈“盐溶”(溶解)状态。经离心分离后得到上清液，再选择一定浓度范围的盐浓度(如25%～60%饱和度的盐溶液)，使SOD呈盐析状态，而另一部分杂质呈盐溶状态，用离心法收集的沉淀即为初步分离制备的SOD。

(2)原料、试剂、仪器

大蒜;壳聚糖螯合吸附剂、硫酸铵等;自动平衡记录仪、高速冷冻离心机、层析柱等。

(3)工艺流程

(4)工艺要点

①粗酶液浸提:将大蒜与pH7.8磷酸钾缓冲液按重量体积比为1∶1.5添加，组织捣碎，在4℃环境中浸提3h，四层纱布过滤，即得粗酶液。

②两次盐析:粗酶液加硫酸铵至55%饱和度，4℃环境中静置过夜，12 000rpm分离心20min，上清液加硫酸铵固体粉末至95%的饱和度，静置3h后离心20min，取沉淀备用。

③亲和层析柱的制备:取以壳聚糖为基质合成的螯合吸附剂装柱，用浓度为0.1mol/L CuSO₄灌柱至饱和。螯合柱用pH 7.8含0.5mol/L NaCl的0.05mol/L的磷酸钠缓冲液进行平衡后备用。亲和层析:取样品上柱，以含0.5mol/L NaCl和0.05mol/L磷酸钠缓冲液进行洗脱，控制流速为1.0mL/min.每3min为一管，并以核酸蛋白检测仪进行监测，收集活性部分。

④透析和冷冻干燥:将活性部分在4℃环境中透析12～24h，冷冻干燥即得成品。

硫酸铵分级盐析法的优点是方便易行，常温下也不易导致酶失活，纯化效果好，与有机溶剂分级沉淀法相比更有利于保持蛋白质的生理活性，但分辨率不及有机溶剂分级沉淀法。

(三)超氧化物歧化酶的修饰工艺

超氧化物歧化酶在体内半衰期短，稳定性差，具有异源蛋白免疫源性和细胞膜的通透性差等缺点。为克服SOD的这些缺点，提高超氧化物歧化酶的稳定性，有必要对超氧化物歧化酶分子进行必要的修饰改造。

目前对SOD分子进行分子修饰改造的途径有:①对SOD氨基酸残基进行化学修饰;②用水溶性大分子对SOD氨基酸进行共价修饰;③对SOD进行酶切修饰。常用的修饰剂有聚乙二醇、硬脂酸、葡萄糖酸内酯、月桂酸、右旋糖酐等。修饰酶不仅完全保留了天然酶的活性，较天然酶稳定，而且在耐热、耐酸、耐碱和抗胃蛋白酶水解能力等方面明显优于天然酶。

1.聚乙二醇(PEG)修饰法

(1)原理

聚乙二醇(PEG)分子末端有两个能被活化的羟基，可以与许多种类的活化剂起反应而被激活，然后再与SOD分子表面赖氨酸残基上的ε－氨基进行修饰，增强了SOD对环境的稳定性。

(2)试剂与设备

聚乙二醇、三聚氰氯、四硼酸钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾等;真空干燥器、冷冻干燥机等。

(3)工艺流程

(4)工艺要点

①聚乙二醇活化:三聚氰氯使用前用新鲜蒸馏过的无水苯重结晶两次。取5.5g三聚氰氯、10g无水碳酸钠及40g聚乙二醇，加入400mL无水苯中，常温下搅拌过夜，过滤。用乙醚沉淀出产物，再用苯溶液沉淀。如此沉淀、溶解反复多次，直至紫外检测无三聚氰氯吸收。真空干燥，得白色固态粉末，在冰箱中密封保存。

②PEG修饰SOD: 10mgSOD加入0.65g活化聚乙二醇，在pH 9.2的四硼酸钠溶液中反应1h。

③冷冻干燥:产物在pH为7.3的磷酸缓冲液透析2h，冷冻干燥得白色粉末状的PEG－SOD聚合物。

聚乙二醇(PEG)有一系列不同相对分子质量的产品，无毒，无免疫原性，是最为常用的修饰剂。

2.月桂酸修饰法

(1)原理

以月桂酸修饰剂，对SOD分子表面赖氨酸进行修饰，提高了稳定性。

(2)试剂、仪器

月桂酸、牛血、氯化亚砜、砒碇DMF、Sephadex G－100;分光光度计、中空纤维透析器、高速冷冻离心机、减压蒸馏装置、冷冻干燥机等。

(3)工艺流程

(4)工艺要点

①月桂酸活化:将月桂酸与氯化亚砜在90℃～95℃搅拌反应2h，回流2h，加入砒碇DMF催化分应，将反应物进行分馏、减压，收集146℃～150℃的馏分，此即活化的月桂酸。

②SOD修饰:将SOD溶于弱碱性PBS缓冲液，加入活化的月桂酸，40℃下搅拌1h后冷却至室温。

③丙酮沉淀:加入丙酮，离心取沉淀，将沉淀用蒸馏水洗涤数次，除去丙酮。

④冷冻干燥:收集酶活性部分，透析、超滤、冷冻干燥即得月桂酸修饰的SOD。

(四)氧化物歧化酶在食品工业中的应用

SOD的应用价值很高，已广泛应用于生物医药、日用美容化妆品的生产中，在功能食品中的应用也极为广泛。

随着SOD资源的开发和制备技术的改良，SOD作为一种抗炎、抗衰老、抗肿瘤、增强免疫的功能性因子，在食品工业中拥有广泛的应用前景。

1. SOD食品营养强化剂

国外把SOD作为食品添加剂应用到口香糖和饮料中。国内也开发出了多种强化SOD的食品，如SOD果汁饮料、SOD的酸奶、SOD雪糕、SOD豆奶、SOD啤酒、SOD冷饮、SOD牛奶、SOD保健酒等类型的功能食品相继面世。这类功能食品具有良好的抗衰老、抗炎、抗辐射、抗疲劳等保健强身的效果。

2. SOD食品抗氧化剂

超氧物歧化酶是一种天然抗氧化剂。目前超氧物歧化酶已被申请作为食品抗氧化剂的专利产品。SOD与其他抗氧化剂一样，添加到罐头食品、果汁、啤酒等，以防止过氧化酶引起的食品变质及腐败现象。SOD还可作为水果、蔬菜良好的保鲜剂。

3. SOD抗衰老保健品

现在已经有SOD胶囊、胶丸、含片、口服液、颗粒剂等形式的SOD抗衰老保健品，市场前景较好。

4. SOD功能性食品

以富含SOD的原料开发了天然功能性食品，比较典型的有大蒜汁、刺梨汁、芦荟汁、菠萝汁等。其中大蒜是SOD含量较高的天然植物之一，利用大蒜组织培养生产富含SOD的功能性食品，具有成本低，实用性强，易实现工业化生产的特点。

在某些发达国家和地区，如日本有SOD糖出售，我国也有SOD泡泡糖、SOD功能饮料、SOD强化牛奶等产品的研制，SOD保健品(制剂或强化食品)已被消费者广泛接受。但SOD的制备提纯工艺复杂，成本高，其在食品中的大量应用仍有一定限制。随着新的SOD来源的开发和制备技术的改良，SOD作为一种高效、安全的功能因子，在食品工业中拥有广泛的市场市场前景。

二、过氧化氢酶(catalase，CAT)

过氧化氢酶是泰纳尔(Louis Jacques Thénard)于1811年被首次发现，并且泰纳尔已经发现了过氧化氢(H₂O₂)。1900年，Oscar Loew将这种能够降解过氧化氢的酶命名为“catalase”，即过氧化氢酶，并发现这种酶存在于许多植物和动物中。

过氧化氢酶，又称为触酶，主要分布在于红细胞及某些细胞内微粒体中，它的主要作用就是催化H₂O₂分解为H₂O与O₂，不至于使H₂O₂与O₂在铁螯合物作用下反应生成毒性更强的OH^－，使细胞免于遭受H₂O₂的毒害。过氧化氢酶是生物防御体系的关键酶之一。

CAT作用于过氧化氢的机理实质上是H₂ O₂的歧化，有两个H₂O₂先后与CAT相遇且碰撞在活性中心上，发生反应。H₂O₂浓度越高，分解速度越快。

过氧化氢酶几乎存在于所有的生物机体中，普遍存在于能呼吸的生物体内，主要存在于植物的叶绿体、线粒体、内质网、动物的肝和红细胞中，其酶促活性为机体提供了抗氧化防御机理。

三、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH－Px)

谷胱甘肽过氧化物酶(GSH－Px)由Mills于1957年从牛红细胞中发现，是在哺乳动物体内发现的第一个含硒酶，故又名硒谷胱甘肽过氧化物酶(Se－GSH－Px)，它是体内清除H₂O₂和许多有机氢过氧化物的重要酶。

GSH－Px的活性中心是硒半胱氨酸，其活力大小可以反映机体硒水平。GSH－Px是机体内广泛存在的一种重要的过氧化物分解酶。Se－GPX存在于胞浆和线粒体基质中，以谷胱甘肽(GSH)为还原剂分解体内的氢过氧化物，能使有毒的过氧化物还原成无毒的羟基化合物，并使过氧化氢分解成醇和水，因而可防止细胞膜和其他生物组织免受过氧化损伤。它同体内的超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)一起构成了抗氧化防御体系，因而在机体抗氧化中发挥着重要作用。

机体在正常条件下，大部分活性氧被机体防御系统所清除，但当机体产生某些病变时，超量的活性氧就会对细胞膜产生破坏。机体消除活性氧O^－2·的第一道防线是超氧化物歧化酶(SOD)，它将O^－2·转化为过氧化氢和水，而第二道防线是过氧化氢酶(CAT)和GSH－Px。CAT可清除H₂ O₂，而GPX分布在细胞的胞液和线粒体中消除H₂O₂和氢过氧化物。因此，GSH－Px、SOD和CAT协同作用，共同消除机体活性氧，减轻和阻止脂质过氧化作用。