纳米复合骨修复材料的研发

2　纳米复合骨修复材料的研发

2.1　材料设计

在经历了第一代惰性生物材料和第二代生物活性材料阶段后，第三代生物材料的设计开始考虑如何在生物体内更好地实现生物学响应^[2]。直接与生物系统作用的骨修复材料，除必须有良好的生物或组织相容性和理化性能外，无论体外增殖培养还是体内在位生长，保证细胞能很好地黏附于支架材料表面对新生骨组织的重建和修复都至关重要。因此，仿生设计制备微观与骨组成相似、细观模拟骨组织表面、宏观具有良好力学性能的新型生物材料，有助于引导骨细胞的黏附（Adhesion），促进细胞的伸展（Spreading）、迁移（Migration）、增殖（Proliferation）和分化（Differentiation），加速骨修复和重建。由模仿骨组织的无机和有机复合构造而发展起来的纳米磷灰石增强复合材料因其仿生性而成为骨修复材料研究的热点^[3]。

2.2　纳米磷灰石晶体的人工合成

羟基磷灰石（hydroxyapatite，HA）的晶体结构与自然骨的无机矿物成分非常近似。大量的体内实验表明，羟基磷灰石植入骨缺损区有很好的修复效果，新骨与其可产生直接的生物性键接^[4]。HA植入体与骨界面的结合强度等于甚至超过植入体或骨自身的强度，当断裂发生，往往是发生在植入体或骨的内部，而不是在界面上^[5]。我们从1992年起就开始了类骨纳米磷灰石晶体的合成与制备，先后成功地制备了不同钙磷比、不同碳酸根含量、不同形貌的纳米磷灰石晶体（图3）^[6，7]，考察了不同极性的溶剂对纳米磷灰石晶体生长的影响^[8]。近年来，随着对纳米晶体功能化要求越来越高，取向纳米磷灰石晶体（图4）、含磁纳米磷灰石晶体（图5）^[9]相继被开发，将用于新型的纳米材料研究中。

（a）纳米针状缺钙磷灰石　　（b）纳米棒状羟基磷灰石　　 （c）纳米烂状碳酸羟基磷灰石图3　不同的纳米磷灰石晶体

图4　纳米羟基磷灰石取向晶体的TEM照片（a）HRTEM（b）SAED衍射花样（c）扫描能谱图和（d）　SEM照片（e）生长机理（f）

图5　针状纳米含磁磷灰石（a）及其磁性测试（b，c）、核壳式结构纳米含磁磷灰石（d）及其磁性测试（e，f）

我们还通过分别合成不同钙磷比的纳米磷灰石晶体，考察其在不同的烧结温度下的形态和基团变化如图6（a，b）所示，利用分子模型如图6（c）所示从晶体学角度解释相转变过程中晶体结构变化，考察晶格内部原子缺位、占位情况，从晶体学角度探讨了水分子在磷灰石晶体中的结构占位。研究表明，一个水分子占据在缺钙磷灰石晶格内，H替代缺位的Ca，可以防止羟基磷灰石结构的塌陷，使得缺钙磷灰石的晶体结构更加稳定。标准羟基磷灰石中不含晶格水，而非化学计量磷灰石中含有晶格水，这或许是非化学计量磷灰石更接近骨矿物质组成的原因，进而也可解释为何自然骨磷灰石在室温下观测不到OH红外峰的原因。更为重要的是，水分子介入晶格可能是促成自然骨磷灰石形成和生长的关键因素。

（a）不同温度处理后样品的XRD图谱

（b）不同温度处理后样品的IR图谱

（c）钙磷比为1.5缺钙磷灰石沿羟基轴的分子模型图6　水分子在纳米磷灰石晶体结构中的占位研究

2.3　纳米复合骨修复材料的制备

制备纳米复合材料的目的在于模拟天然骨组织组成或结构，在保持无机组分强度性能和生物活性的同时，维持高分子基质固有的韧性特征和吸能特性（如图7所示）。粒状或纤维状的无机组分均可加入高分子基体，但这些添加物的尺寸大小是影响复合材料力学性能的重要因素。由于纳米级和微米级添加物形成的复合物微观结构差异很大，在这些添加粒子和高聚物基质间存在显著不同的界面形态。纳米粒子在高聚物中的结构也更接近天然骨的组织构造，由此可获得更为理想的力学性能。相对于微米粒子，纳米级充填物的引入可更好地实现复合材料的力学强度和刚性的增强。对比研究表明[10，11]，纳米粒子的加入有利于复合材料植入后与自然骨实现力学性能的匹配，有效地避免了金属植入物可能造成的应力刺激吸收和应力屏蔽问题。

本研究组[12]等将纳米HA浆液在溶剂DMAC存在的情况下于100～120℃脱水，然后加入具有类胶原酰胺基元的聚酰胺高分子（polyamide 66，PA66），在PA66逐渐溶解的过程中，纳米HA晶体均匀分布于聚合物基体中，复合材料组成均一，纳米HA晶体和PA66间由大量氢键结合，表现出与皮质骨相似的力学性能。采用原位共沉淀法[13]成功制备了在聚酰胺66的DMAC溶液中均匀分散的针状纳米HA晶体，不仅提高了纳米HA在复合材料中的含量，同时还保持了复合材料机械力学性能。所开发的纳米磷灰石“常压合成工艺[14]”实现了新的突破，在低于聚酰胺的热敏温度下可进行不同类型聚酰胺与纳米磷灰石的复合，避免了复合条件可能引起的材料氧化变性，有利于保持制品的稳定和均一。

2.4　骨组织工程支架的构建

相对于自体和异体骨移植，骨组织工程是最具潜力的骨缺损修复替代解决方案，可提供比目前常规移植手术更佳的选择性，减少应力屏蔽和血管损伤的发生，以及骨质减少和再次骨折的发生[15]。临床对更适于生理环境的植入物的大量需求促进了组织工程修复材料的发展。

模拟骨组织的细胞外基质拓扑结构和微观结构，最关键的因素是多孔支架的微观结构，如孔径及孔径分布、孔隙率、孔间连通性等，且支架应具备一定机械强度和解剖学外形，并与所要修复的组织相吻合[16]。孔径大小作为影响硬组织修复材料组织相容性的重要参数，一般认为微孔可允许体液、组织液的进入，营养物质和氧气进入、代谢产物的排出；1～50 μm的小孔有利于纤维组织和毛细血管长入以及营养物质传递；50～100 μm的小孔，允许类骨组织长入；＞100 μm的孔隙适于骨组织长入，其中100～600 μm的孔结构更有利于骨细胞和骨组织长入[17]。

对骨组织工程支架而言，无论用何种方式制备何种形貌的支架，支架所承担的生物学角色都应是介导骨细胞反应的类细胞外基质的作用[18]。一种成功的骨组织工程支架结构，必定是形貌特征和力学性能的平衡，并在后续的转化中能维系再生组织和支架降解之间的平衡。因此，在骨组织工程支架材料的制备过程中，除了原材料选择和后处理外，制备工艺对于多孔支架的力学性能影响最大[19]。不同的制备工艺决定了支架的宏观结构、微观结构以及部分力学性能和降解性能。因此，能使富含活性物质的高聚物基质产生理想孔径和有序结构的技术就成为骨修复支架构建的基础。我们在前期制备纳米磷灰石/聚酰胺复合材料的基础上，利用相转移法成功制备孔径孔隙与松质骨相似的支架结构，用于进一步骨组织工程研究[20]。

图7　骨修复用纳米复合多孔支架的制备

2.5　生物因子缓释支架

目前临床局部应用生物因子时容易被内环境稀释和代谢，难以持续发挥作用。反复注射价格昂贵，并有可能引起毒副作用。因此，结合多孔支架成型技术，利用药物载体相关知识，构筑生物因子缓释系统，控制释放生长因子，调控再生组织的形态形成，加速组织修复，满足材料降解与组织再生匹配的临床要求^[21，22]。物理支架与有生命特质的生物分子结合，可有效促进骨组织工程支架生物学功能的表达：促进新生血管形成，促进软组织、软骨、骨组织及神经组织损伤的修复。

我们通过腺病毒质粒pGEM-T介导，成功地在体外将大鼠生长因子BMP-7骨形成蛋白基因转入兔骨髓基质细胞（MSCs）中，然后将其与纳米复合支架复合，无免疫排斥反应，也不影响细胞增殖及表型分化。实验结果表明，支架材料对转染细胞的活力没有影响，由细胞进行表面修饰的组织工程杂化支架对缺损的早期修复速度明显快于纯n-HA/PA支架，基因技术结合组织工程技术在动物体内能早期诱导大量新骨生成（如图8所示）。该类仿生活性支架的研究对于制备出具有良好生物学活性的组织工程化人工骨以高质量地修复骨缺损具有重要意义^[23]。

转染示意图

RT-PCR扩增BMP7基因电泳图

实验组术后12周

RT-PCR检测转染后兔MSCs中大鼠BMP7基因表达电泳图：标本1、2、3、4、5、6为实验组阳性标本；标本7、8为对照组阴性标本M为Marker

空白术后12周

图8　组织工程化多孔n-HA/PA66修复体用于兔下颌骨缺损修复

2.6　取向骨修复材料研究

同其他天然材料一样，骨组织的基本组成、形状、尺寸和空间位置决定了骨内在结构和性能的各向异性。Ortiz^[24]等的研究结果证实，正常骨比脱钙骨拥有更高抗压强度的根本原因在于：取向排列的纳米磷灰石晶体间的摩擦力比晶粒间的滑动更有利于抗压承力。量化分离胶原纤维的空间分布后，实验和模拟计算也证明这种纳米粒子的各向异性促进了骨受力时的能量耗散^[25]。这种各向异性结构和组成对材料性能的影响已引起研究者的高度关注，目前主要集中于取向磷灰石晶体的合成^[26]和三维多孔取向结构的研究^[27]，如图9所示。

文献^[28]报道了采用相转移法、冻干法以及层叠组装法等方法成功制备出取向的三维多孔结构。本研究组采用相转移法制备了各向异性纳米羟基磷灰石/聚酰胺（n-HA/PA）支架结构^[28]，细胞和动物实验表明取向性孔道结构比各向同性结构具有更佳的骨传导性^[29]。

图9　取向多孔纳米复合支架的制备及发泡机理

2.7　软骨/骨一体化修复体研究

除了儿童，成人的软骨再生能力非常有限，成人软骨受到破坏发生坏死，被破坏的软骨通常由永久性的纤维组织连接，最终软骨退变，以软骨成骨的方式发生二次成骨替代，因此直径大于3 mm的关节软骨临床几乎不能完全修复。我们在前期深入剖析关节微结构的基础上，设计和制备出下层能长入骨、上层能替代软骨组织的新型嵌层生物材料，研究了通过中间过渡层将上部PVA水凝胶与下部n-HA/PA多孔支架界面连接的工艺方法，制备出具有牢固界面连接的一体化软骨与骨组织嵌层修复体[30]。开展BMSCs的体外培养及成骨、成软骨双向诱导研究，并与PVA/Gel—n-HA/PA6一体化修复支架复合，构建双向分化型组织工程骨。结果发现，经过成软骨诱导的BMSCs在PVA/Gel微孔层能维持成软骨细胞的表型特征，并分泌出大量软骨样基质，形成大量II型胶原，大体形态与组织结构与正常软骨相似。在n-HA/PA6多孔支架内可见新形成的编织骨和支架材料分布于完全矿化的细胞间基质中（如图10所示）。在术后8周时，将骨软-骨复合物分为软骨部分和骨部分，分别行PT-PCR反应，结果表明诱导组在II型胶原和I型胶原的表达上明显高于对照组。结果说明，将分化干细胞与PVA/Gel-n-HA/PA6材料体外复合培养后再植入缺损处，能加快体内缺损的修复，尤其是在早期修复时能减少修复时间，明显优于对照组，对临床修复有重要参考意义。

图10　软骨/骨一体化纳米复合修复体用物兔膝半关节组织修复