辅酶Q10高产菌株的选育
李静1 戚薇1 李剑2 杜连祥1
（1.天津科技大学生物工程学院天津市工业微生物重点实验室 天津 300222
2.天津天士力集团有限公司生物技术和生物制品研究开发中心 天津 300402）
摘要：本文采用NTG对Agrobacterium sp.T28进行诱变，通过筛选辅酶Q10的结构类似物甲萘醌（Vk3）抗性突变株的方法，获得了两株辅酶Q10的高产突变株，编号为R-0630-14和R-0601-12，其辅酶Q10产量分别为57.3 mg/L和59.9 mg/L，较出发菌株（42.3mg/L）提高了35.7%和41.6%。通过传代实验，证明该突变株遗传性质稳定。应用于本实验的方法为：将甲萘醌溶于DMF （N，N-二甲基甲酰胺）中，浓度为15 mg/ml，再加入含有3%吐温80乳化剂的培养基中，抗性培养基平板的单倍抗性浓度为： 0.15 g/L。
关键词：辅酶Q10；抗性突变株；诱变
辅酶Q10又称为泛醌，是一种类维生素类物质，化学名称2，3-二甲氧基-5-甲基-6-癸异戊烯基苯醌（结构如图1） 。辅酶Q10在自然界中分布广泛，主要存在于酵母、植物叶子和种子及动物的心脏、肝脏和肾脏中。在真核细胞内与线粒体内膜相结合，在原核细胞内则存在于细胞质膜中，是呼吸链的重要递氢体[1]。
辅酶Q10是生成ATP的必需辅酶，具有消除自由基、抗氧化、提高机体免疫力等功能，已广泛应用于临床，在治疗心脑血管疾病、心脏病、循环衰竭方面具有重要地位和作用[2]。
辅酶Q10的生产方法有动植物组织提取法、化学（或半化学）合成法和微生物发酵法，其中微生物发酵法具有不受原料限制、反应条件温和、分离纯化过程相对简单和产品临床价值高等优点。
图1 辅酶Q10结构[3]
国内外所报道的辅酶Q10生产菌株大多为细菌，如假单胞菌属、红色杆菌、荚膜黄杆菌、土壤杆菌属、硫杆菌、红极毛杆菌、脱氮极毛杆菌、氢极毛杆菌、甲烷微球菌、脱氮副球菌、光合细菌等；还有酵母菌属的菌，如假丝酵母、尚德尔酒香酵母、隐球酵母等[1]。本文以自然界分离到的土壤杆菌（Agrobacterium sp.） T28为出发菌株，通过NTG诱变，筛选抗结构类似物甲萘醌（Vk3）的突变株，以获得辅酶Q10的高产突变株。
1 材料与方法
1.1 出发菌株
土壤杆菌（Agrobacterium sp.）T28。
1.2主要仪器设备
Agilent 1100高效液相色谱仪（美国安捷伦公司） 。
1.3 试剂
甲萘醌（Vk3，Menadione）和CoQ10标准品为Sigma公司产品，其他试剂均为国产分析纯。
1.4 培养基
1.4.1 种子培养基（%，w/v）
葡萄糖2，蛋白胨1，酵母膏1，NaCl 0.5，pH值7.2。
1.4.2 发酵培养基（%，w/v）
葡萄糖3.8，蔗糖4.0，玉米浆4.0，（NH4）2SO41.0，KH2PO40.06，K2HPO40.06，MgSO4·7H2O0.03，pH 7.6。
1.4.3 完全固体培养基（%，w/v）
葡萄糖0.5，蛋白胨1.0，酵母粉0.3，MgSO4· 7H2O0.2，琼脂粉1.5，pH 7.2。
1.4.4 抗性平板培养基（%，w/v）
完全固体培养与吐温80体积比为100∶3，200 r/min振荡40 min混匀后，121℃高压蒸汽灭菌20 min，该培养基与15 g/L甲萘醌的DMF母液按体积比100∶1 .0混匀，制成抗性平板。
1.5 培养方法
取一环斜面培养物，接入装有20 ml种子培养基在250 ml三角瓶中，30℃，摇床转速250 r/min振荡培养24 h。将种子培养液以1%的接种量接入装入30 ml发酵培养基的250 ml发酵瓶中，摇床转速300 r/min振荡培养，30℃培养72 h。8 000 r/min离心5 min收集菌体。
1.6 NTG诱变方法[4]
取对数期菌体用磷酸缓冲液（pH6.0）洗涤2次，最后悬浮于磷酸缓冲液中，使细胞浓度为l08个/ml。将NTG溶解于0.l mol/L的磷酸缓冲液中（pH6.0） （先用少量丙酮溶解） ，母液浓度为40 mg/ml。将母液加入菌悬液中，使NTG终浓度为1 mg/ml。在30℃振荡处理5min、10min、15min、20min、25min和30 min，离心收集菌体，用无菌水洗涤3次，适当稀释后涂布于完全培养基平板，30℃培养，计算存活率。
1.7 细胞干重的测定
发酵液经8 000 r/min离心15 min后，弃上清液，将菌体沉淀用去离子水洗2次，菌泥80℃干燥至恒重后称重。
1.8 辅酶Q10粗提品的制备[3]
1.9 Q10的定量检测：高效液相色谱法（HPLC）[5]
色谱条件： HypersilODS色谱柱，250 mm×4.6 mm不锈钢色谱柱，填料为十八烷基硅烷键合硅胶，直径为10 μm ；流动相比V（甲醇）∶V（乙醇）= 1∶1 ；体积流量1 ml/min；检测波长210 nm；温度30℃；进样量20 μl。
2 结果与讨论
2.1 NTG诱变剂量-存活率曲线
NTG是一种高效诱变剂，能在较低的致死率下得到较高的突变率。据报道，NTG的最适作用浓度1 mg/ml[3]。实验以NTG为诱变剂（作用浓度为1 mg/ml） ，分别对Agrobacterium sp.作用5min、10min、15min、20min、25min和30 min，测定不同作用剂量下菌体的存活率，见图2。
图2 剂量-致死率曲线
由图2可见，NTG作用5 min时的菌体致死率为40%，随作用时间的延长，存活率迅速下降，作用15 min时的杀菌率即为85%。据研究报道，在产量变异中，正向突变较多出现在偏低剂量中，而负向突变较多出现在偏高剂量中，紫外线等诱变剂倾向采用杀菌率在70%～80%甚至更低的剂量，NTG的最适剂量也应在较低的杀菌率范围内[7]。故实验采用NTG诱变处理的时间为5 min，即以杀菌率40%的剂量作为诱变剂量。
2.2 结构类似物抗性突变株的选育
由于正常的合成代谢的最终产物对有关酶的合成有阻遏作用，对合成途径的第一个酶具有反馈作用。而抗结构类似物突变株往往是变构酶结构基因发生突变，使变构酶调节部位不再能与代谢拮抗物相结合的抗反馈突变型，或是调节基因发生突变，使阻遏物不能再与代谢拮抗物结合的抗阻遏突变型，因此，选育抗结构类似物突变株，代谢调节可被遗传性地解除，是定向选育高产菌株的有效方法。
2.2.1 甲萘醌临界浓度的确定和抗性平板的制备
甲萘醌（维生素K3）是辅酶Q10的结构类似物，同时具有阻断呼吸链电子传递的作用。甲萘醌抗性突变株不仅解除了反馈抑制或反馈阻遏，而且具有较强的自我修复功能，故实验通过选育甲萘醌抗性突变株以筛选辅酶Q10高产菌株。
由于甲萘醌为脂溶性物质，不溶于水，故实验先将甲萘醌溶于DMF （N，N-二甲基甲酰胺）中，再加入含有3%吐温80乳化剂的培养基中。DMF是一种溶解性很强的溶剂，既能溶解脂溶性物质又能溶解水溶性物质，实验首先考察了甲萘醌在DMF中的溶解度，接着确定甲萘醌的DMF合适的母液浓度（因甲萘醌的DMF母液直接与水混合会产生沉淀，故使用3%的吐温80增溶） ，然后考察了DMF添加量对菌体生长的影响（见表1） 。
表1 DMF浓度对菌体生长的影响
注： +表示生长，-表示菌体不生长。
实验配制甲萘醌浓度为15 mg/ml的DMF溶液，将不同量（0.2 ml～2.0 ml，间隔0.2 ml）的该甲萘醌溶液加到100 ml完全培养基中（含3%吐温80） ，制成含甲萘醌0.03 g/L～0.30 g/L的抗性平板，然后将培养至对数期的菌液0.1 ml涂布于平板上，30℃培养48 h后观察菌体生长情况，以确定抗性平板中甲萘醌的临界用量（见表2） 。
表2 抗性平板中甲萘醌的临界用量的确定
注： +表示生长，-表示菌体不生长。
由表1可知，DMF在固体培养基（含3%吐温80）中不影响菌体生长的最大浓度为2.5% （v/v） ；表2看出，当甲萘醌在培养基中浓度达到0.15g/L时，菌体生长被抑制，故确定甲萘醌在抗性平板中的临界浓度为0.15 g/L。
2.2.2 辅酶Q10高产菌株高产菌株的选育
将NTG诱变处理的菌体，涂布在含甲萘醌0.15 g/L的抗性平板上进行培养。将抗性平板上长出的小菌落，即结构类似物抗性突变株，挑入斜面，进行摇瓶发酵并测其辅酶Q10产量。实验从抗结构类似物突变株中筛选到二株辅酶Q10产量有较大提高的突变株，编号为R-0630-14和R-0601-12，其Q10产量分别为57.3 mg/L和59.9 mg/L，较出发菌株（42.3mg/L）提高了35.7%和41.6% （见表3） 。
表3 突变株与原始菌株比较情况表
突变株R-0630-14和R-0601-12的菌落颜色较出发菌株均发生了变化，出发菌株的菌落为淡红色，而突变株颜色变浅。菌落颜色变化，说明色素合成途径可能被阻断，致使异戊二烯合成途径上的代谢流更多的集中于异戊烯基焦磷酸（IPP）的合成，而与辅酶Q10共用非甲羟戊酸途径（nonmevalonate pathway）的类胡萝卜素等有色物质的合成则变少或被截断，有利于辅酶Q10的积累。
2.2.3 突变菌株的遗传稳定性
分别将所得到的辅酶Q10高产突变株在斜面上连续转接10代，测定各代培养物在摇瓶条件下的辅酶Q10产量及产率，结果如下表4所示。
表4 突变菌遗传稳定性试验结果（辅酶Q10产量/mg · L-1）
从表4中可以看出，以上两个高产突变株连续转接10代，辅酶Q10的产量均没有显著下降，说明突变株的遗传稳定性较好。
3 讨论
本文以甲萘醌抗性作为筛选高产辅酶Q10突变株的筛选模型，采用亚硝基胍对Agrobacterium sp.T28进行诱变处理，获得了两株辅酶Q10产量提高的稳定突变株。通过将甲萘醌溶于DMF （N，N-二甲基甲酰胺）中，再加入含有3%吐温80乳化剂的培养基中，解决了甲萘醌在培养基中溶解性差的问题。
在获得该抗结构类似物突变株的基础上，采用其他诱变剂进一步诱变，筛选芳香族氨基酸缺陷型菌株，以切断芳香环向芳香族氨基酸的代谢通路，解除代谢途径中DAHP酶受苯丙氨酸和酪氨酸的协同反馈抑制，或单一芳香族氨基酸存在的反馈抑制，去除不必要的代谢支路，可得到辅酶Q10的高产菌株。
参考文献：
[1]吴祖芳，翁佩芳，李寅，陈坚.辅酶Q10发酵生产的育种思路及发酵条件优化策略[J].食品与发酵工业，2001，27 （7）:49～53
[2]王淑英，郭忠富.辅酶Q10的生物学功能及临床应用.齐齐哈尔医学院学报，1994，15 （1）:47～50
[3]刘克杉，吴文芳，韩斯琴，徐梅，吕安国，孙静波.辅酶Q10高产菌株的选育.沈阳农业大学学报，2005，36（1）:89～92
[4]王根华，钱和，肖刚.发酵菌体中辅酶Q10的提取及其测定方法[J].无锡轻工大学学报，2003，22 （2） ：59～62
[5]相田浩.辅酵素Q10の制造法，日本特许公报[P].日本专利：昭57-18869，1982-04-19
[6]鲁珀特·普法勒，苏珊·莱昂哈茨贝格尔.辅酶Q10产量增高的Sporidiobolus ruineniae菌株的生产方法[P]中国专利： CN1584010A，20041003
[7]陶文沂.工业微生物生理与遗传育种学[M].北京：中国轻工业出版社，1996
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