微生物产果胶酶的分子生物学研究进展

微生物产果胶酶的分子生物学研究进展

冯　红　刘晓兰

（齐齐哈尔大学生命科学与工程学院黑龙江省高校农产品加工重点实验室　齐齐哈尔　161006）

摘要：果胶酶是作用于果胶质的一类酶的总称，本文综述了果胶酶基因的结构、功能、调控、转录后加工等方面的研究。已克隆的微生物以真菌为主;克隆的果胶酶基因以多聚半乳糖醛酸酶（PG）基因、果胶裂解酶（PL）基因和果胶酯酶（PE）基因为主，大多有内含子;前体蛋白一般有N2信号肽和糖基化位点。

关键词：微生物果胶酶分子生物学研究进展

果胶酶是一种能分解果胶的酶系的总称^[1]，可将果胶分解为半乳糖醛酸等物质。果胶质为杂多糖，它广泛地分布于植物的果实、茎、叶、根中，主要存在于植物的初生细胞壁和胞间层中。它的主要成分是由D-半乳糖醛酸联结而成的长链，还含有其他的糖类物质，如： L-阿拉伯糖、D-半乳糖、L-鼠李糖、D-木糖、D-葡萄糖等。原果胶、果胶和果胶酸是果胶质的3种主要类型。在20世纪30年代，美国就已将果胶酶用于果酒的澄清。过去在果胶酶的研究中，对酶活性较高的霉菌研究较多^[2]，细菌研究得较少，主要是其中的芽孢杆菌（Bacillus） 、节杆菌（Arthrobacter） 、软腐病菌（Carotovora）和霉菌中的曲霉（Aspergillus） 。

果胶酶若按作用机理可分为β消除反应酶及水解酶： β消除反应酶催化的反应是内切的，它将分子链中无规则部位的聚合物切断，生成低聚体的混合物；水解酶是外切的，它作用于高聚物分子链的端部，使分子链水解，最后形成单体或二聚体。果胶酶若按其作用底物来分，可分为果胶酸酶、果胶酶和原果胶酶，其作用底物分别为果胶酸，果胶（低脂化度的果胶）及不溶性的原果胶。果胶是指甲脂化的多聚半乳糖醛酸，果胶酸则是脱甲酯的多聚半乳糖醛酸物质，二者均溶于水。原果胶是不溶性果胶的总称，它不溶于水，可能是由多个果胶分子联结在一起，也可能是由果胶质与半纤维素等成分以共价键结合而成。

1　原果胶酶的分子生物学研究

1.1　原果胶酶的同源性研究

1978年日本学者Sakai等发现帚状丝孢酵（Trichoporon penicillatum）能产生一类使植物组织中的原果胶水解生成果胶物质的酶（Protopectinase）^[3]。原果胶酶按作用机理可分为A型和B型： A型原果胶酶是切断原果胶中的聚半乳糖醛酸部位;B型原果胶酶是切断原果胶中的其他部位，使水溶性的果胶分离出去。

Iguchi等研究表明，在Trichosporon penicillatum发酵液中同时存在着三种不同的原果胶酶（PPase-SE1，-SE2，-SE3）^[4]。对PPase-SE3基因克隆及表达的结果表明，PPase-SE3的氨基酸序列与其他真菌中聚半乳糖醛酸酶氨基酸序列的同源性较大，而与细菌以及植物中聚半乳糖醛酸酶的同源性较差。然而，无论在细菌，真菌及高等植物中，聚半乳糖醛酸酶Asp204位至Thr262位区域高度保守，这一区域也许是底物（如多聚半乳糖醛酸）的结合部位和酶的活性中心^[5]。

1.2　原果胶酶调控的研究

1.2.1　磷酸盐的诱导作用

有些菌株需在一定的条件下才能产原果胶酶，如培养Bcillus subtilis时，当培养基中磷酸盐浓度很低时，几乎不产酶，而当培养基中磷酸盐浓度高时，虽然抑制细菌的生长，但是可以提高产酶量。Sakamoto等对Bacillus subtilis裂解酶基因研究的结果表明，该基因的表达受到高浓度的磷酸盐诱导。

1.2.2　pH调节系统

Aspergillus中一些菌株能产生耐强酸的原果胶酶，且酶对pH的耐受程度受培养基中pH影响。目前认为在这种原果胶酶基因的启动子中存在着锌指转录因子-PaCC的结合部位。当培养基中pH偏碱时，PaCC有活性，激活“碱性”基因的表达（表达产物耐碱） ，抑制“酸性”基因的表达（表达产物耐酸）^[8]。然而，关于pH调节的详细机理仍有待进一步研究。

2　果胶酶的分子生物学研究进展

2.1　结构与功能

果胶酶基因的开放读码框（OFR）绝大多数被内含子分隔，内含子最多的达7个，果胶酶的前体蛋白N信号肽一般为16～27AA，个别如曲霉菌的多聚半乳糖醛酸酶的前体蛋白（PGC）有一个较长的N信号肽（40AA） ，有的PL无N信号肽。许多果胶酶都有糖基化位点，如串珠镰孢内切多聚半乳糖醛酸酶（endo-PG）前体有4个糖基化位点。串珠镰孢endo-PG的His234对酶活性和浸解活性起关键作用，与结合PG1P无关，当His234→Lys时无酶活性，Ser237和Ser237→Gly时，酶活性降低48%和6%。

2.2　表达与调控

果胶酶一般受果胶、植物维管组织、低浓度的（0.1%） D-半乳糖醛酸、半乳糖诱导，受葡萄糖、较高浓度（1%）的半乳糖醛酸、抗体、某些抗菌素（如阿莫西林） 、植物的PG抑制蛋白（PGIP）抑制。Ca²⁺抑制一些PG，而一些PL的活性需Ca²⁺参与。

2.3　加工和输出

果胶酶一般有糖基化位点，功能酶以糖蛋白形式存在。如玉米圆斑病菌PGx1N端有12AA的糖基化位点，糖蛋白分子量60kDa，去糖基后表观分子量45kDa^[27]。核盘菌在多聚半乳糖醛酸的培养基上培养的早期分泌的2种endo-PG都是糖蛋白。番茄根腐尖镰孢外切聚半乳糖醛酸酶（exo-PG）的糖基化程度高，糖蛋白形式存在时分子量为66kDa，去糖后50kDa。不过似以黑曲霉的endo-PC糖基化程度最高。果胶酶一般输出到胞外，如啤酒酵母的endo-PG。

2.4　多聚半乳糖醛酸酶（PG）

（1990）从商品的黑曲霉（A.niger）果胶酶分离到5种endo-PG和一种exo-PG。主要的endo-PG为endo-PGI和endo-PGⅡ，分子量分别为55kDa和38kDa，两者的等电点、比活、对寡聚底物的作用方式及氨基酸组成全然不同。另外3种endo-PG即endo-PGⅢA、endo-PGⅢB和endo-PGⅢC的生理活性与endo-PGI极相似。其后从黑曲霉基因组文库分离出几个基因，编码的endo-PGE分子量35.6kDa，pI=3.6，最适pH=3.8。endo-PGE与endo-PGC的AA序列同源性最高，有77.6%相同，与endo-PGI和endo-PGⅡ的同源性较差，分别为57.6%和54.3%相同^[9]。

黄曲霉（A.flavus）两个PG基因即pecA和pecB，前体蛋白预期分子量分别为37.6kDa和38kDa^[11]。 A.parasiticus的endo-PG基因pecA用黑曲霉pgaⅡ做探针分离到，与其他真菌的PG基因极相似。A.tubigensis的endo-PG基因pgaⅡ与A.niger的pgaⅡ基因的核苷酸序列有83%相同，前体蛋白AA序列94%相同。

最初从在苹果果胶上培养的灰霉菌分离得到5种PG同工酶（Ⅰ-Ⅴ） ，4个酸性，1个碱性，pI分别为9.3、4.9、4.6、3.7、2.7，其中以PGⅢ比活最高，PGⅠ为内切酶，另4种为外切酶。后来从灰霉菌引起的苹果腐败组织中分离到1种exo-PG，表观分子量为45kDa，pI=4.6，与此菌在液体培养时产生的同工酶pI、最适pH和作用方式相似。另用A.niger的pgaⅡ基因做探针从灰霉菌分离到6个endo-PG的编码基因，这6个基因编码的endo-PG前体的氨基酸序列有34%～73%相同，可分到3个单源（monophyletic）组中^[12]。

番茄尖镰孢（Fusariumoxysporumf.sp.lycop-erici）的一种主要胞外endo-PG，其前体蛋白分子量41.1kDa，成熟蛋白推算分子量为35.5kDa，pI=6.2，与F.moniliforme的PG、C. carbonum的PGN1、A.niger的PG、A.oryzae的PG和S.sclerotiorum的PGⅠ分别有82.9%、29%、27.6%、14.2%和26.9%同源性^[13]。

菜豆炭疽病菌（Colletorichum linder murhianum）已有2个endo-PG基因被克隆，其中pg1编码主要的endo-PG，这个基因在病菌腐生时和在侵染植物时都表达。在菜豆坏死组织中检测到，与细胞壁大量降解有关，RT-PCR表明在侵染的死体营养阶段开始时pg1表达。pg1与pg1AA序列有61%相同，与其他真菌的endo-PG有37%-59%相同^[15]。

核盘菌（Sclerotinia sclertiorum）的endo-PG有多种等电点不同的同工酶，其中pg1是一种中性蛋白，endo-PG2和endo-PG3的等电点分别为4.8和4.9，分子量相似，氨基酸组成上仅在天冬氨酸-天冬酰胺组成上不同，与PG1氨基酸序列分别有90%和89%相同。用PG3制备的抗体与PG2有交互反应，但不与黑曲霉PG反应。 endo-PG由多基因家族编码，7个基因构成这个家族的2个亚家族。比较这个基因家族的3个成员的编码区的核苷酸序列，发现差异很小^[16]。

玉米圆斑病菌（Cochliobolus carbonum）的1个endo-PG基因pgn1和1个endo-PG基因pgx1已分离到，pgx1产物PGX1前体推算分子量为48kDa，与A.tubingensis的endo-PG有61%氨基酸相同。pgx1突变菌系在果胶上生长慢，对玉米仍致病，pgn1 / pgx1双突变菌系尽管PG活性只及野生型1%，但仍对玉米致病^[17]。

啤酒酵母（Saccharomy cescerevisiae） CECT1389菌系一种endo-PG表观分子量39kDa，最适pH为55，最适温度为45℃。啤酒酵母endo-PGPG与其他真菌的PG有54%同源，与植物和细菌的PG只有24%同源；每个单倍体只有1个单基因拷贝^[18]。

2.5　果胶裂解酶（PL）

PL的作用是随机的断裂半乳糖醛酸链上的β-1，4糖苷键，产生含不饱和C4-C5键的寡聚半乳糖醛酸^[19]。病原菌中有许多不同基因编码的果胶裂解同工酶。主要是曲霉菌和镰孢菌产生PL，此外还有P.oxalicum、啤酒酵母和灰霉。从黑曲霉已克隆到6个PL编码基因，即pelA、pelB、pelC、pelD、pelE和pelF，其中pelA和pelD分别编码商品果胶酶Ultra2m的两种主要PL即PLⅠ和PLⅡ。

从茄镰孢豌豆专化型（F.solani f.sp.pisi）分离到4个endo-PL基因，即pelA、pelB、pelC、pelD^[19]。 pelA编码的endo-PLA前体蛋白29kDa，成熟蛋白26kDa，pI=8.3，最适pH=9.4。 pelB编码的PLB分子量为25.6kDa，最适pH值10.0。与PLA的AA序列有65%相同，PLA和PLB与其他果胶酶无明显的同源性。pelC编码的PLC分子量23.3kDa，与PLA有血清关系，AA序列与有51%相同，最适pH9.5，最适温度55℃。pelD编码的PLD分子量24.5kDa，成熟蛋白分子量22.7kDa，AA序列与PLA、PLB、PLC分别有49%、44%、65%相同。

番茄尖镰孢编码PL1的基因与茄镰孢豌豆专化型（F.solanif.sp.pisi）的pelA、pelB、pelC和pelD基因分别有89%、67%、55%和56%相同^[20]。

2.6　果胶酯酶（PE）

果胶酯酶的功能是催化脱除半乳糖醛酸羧基上的甲醇基，从而有利于PG分解半乳糖醛酸链。对果胶酯酶结构和基因方面的研究，目前研究的最多的是番茄和柑橘中的果胶酯酶。但也有不少学者将果胶酯酶从草莓、烟草以及一些真菌中得到克降与表达。Spok · A等^[24]从假单胞菌属solanacearum中分离出两种果胶酯酶，它们在埃希氏大肠杆菌中表达水平不同。这两种克隆体均含有一条包含果胶酯酶编码的DNA共同片段，通过限制性分析、再克隆和进一步的核酸外切酶删除得到一个1.3kb的基因片段，并且含有一个1188bp的开放阅读框，分子量为41kDa左右。

Stephan · C等对细丝状真菌针尾曲霉果胶酯酶的纯化、克隆、特性和基因序列进了研究表明，克隆得到的是一个分子量43kDa的果胶酯酶基因片段PMEⅠ长度为1195bp的cDNA基因含有一个993bp的开放阅读框，位于核苷32位上有一个ATG起始密码子，在核苷1025位上含有一个TAA终密码子。这个开放阅读框架位于31bp的5′端非编码区域之前，171bp的3′端非编码区域之后，并且含有一个poly -A尾巴。氨基酸序列分析表明针尾曲霉的PMEⅠ与黑曲霉的PME具有83%的相似性和74%的一致性，并且测出四个保守区域^[26]。

3　总结

果胶酶的多样性使我们在利用果胶酶时有了更大的选择余地。对于一些产果胶酶也产致癌毒素如黄曲霉素，可将其果胶酶基因转入不产毒素的微生物如酵母菌和米曲霉中。为得到单一的果胶酶，可将其基因克隆到不产果胶酶的相近微生物中。用强启动子如TEF1 a启动子取代果胶酶基因原有的启动子或在果胶酶的发酵生产中加入果胶酶诱导物可用以提高产量。富含果胶的物质如苹果渣既是果胶酶诱导物和底物，也是果胶酶的良好载体。而在果实贮藏期间可用果胶酶抑制物处理或转PGIP基因入植物可防软化。果胶酶分子生物学的进一步研究将有助于更合理地利用果胶酶。

4　展望

随着生物技术的发展，化学的方法、包括化学合成、化学水解等工艺正在被酶催化合成和水解所代替。利用果胶酶处理果蔬加工废弃物来生产果胶，不仅可以充分利用果蔬资源，生产高质量的果胶，同时还可以减少环境污染和节省能量。目前我国果胶生产停滞不前，国内市场优质果胶产品主要靠进口。因此，立足本国实际，利用果胶酶作用于食品工业再生资源（如柑橘皮、苹果渣等）生产果胶，具有很大的经济效益和社会效益。同时，我国又是棉、麻生产大国，研究果胶酶在脱胶方面的应用，将为该领域的竞争注入新的活力。

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