代谢产物丁酸对酪酸菌生长的抑制及其解除方法研究

代谢产物丁酸对酪酸菌生长的抑制及其解除方法研究

路福平　史文玉

（天津市工业微生物重点实验室天津科技大学生物工程学院　天津　300222）

摘要：制备酪酸菌微生态制剂首先要实现酪酸菌的高密度培养，而其代谢产物对酪酸菌生长的抑制较为严重。实验证明，代谢产物丁酸是酪酸梭状杆菌生长的主要抑制物。利用离子交换树脂吸附发酵液中的丁酸，消除丁酸对酪酸菌生长的抑制，为实现酪酸菌的高密度培养创造了条件。实验从18种树脂类型中选出了两种性能良好的树脂A和B，这两种树脂对10g/L丁酸溶液中丁酸的静态吸附量分别为0.243 g/ g和0.240g/g。动态吸附试验表明，这两种树脂吸附性能良好，再生性能优良。5L发酵罐实验表明，发酵残液经陶瓷膜过滤，再经过离子交换树脂脱酸后，重新补充新鲜培养基打入发酵罐中进行循环使用，大大降低了原发酵液中丁酸对酪酸菌生长的抑制，大幅度提高了菌体浓度，达到2.521×10¹⁰个/ml。

关键词：酪酸菌；丁酸；抑制；树脂

酪酸菌即丁酸梭状芽孢杆菌（Clostridiun butyricum）是1933年由日本千叶医科大学宫入近治博士首先发现并报告的，因此又名宫入菌。酪酸菌存在于土壤、动物和人体的肠道中，细菌学分类归属于梭菌属，为革兰氏阳性厌氧杆菌。菌体中常有圆形成或椭圆形芽孢，使菌体中部膨大呈梭形。酪酸菌能发酵葡萄糖、蔗糖、果糖、乳糖等碳水化合物，并能够产生淀粉酶分解淀粉，水解淀粉和糖类的最终代谢产物主要为丁酸、醋酸和乳酸等^[1，2]。

酪酸菌是调节人体肠道微生态平衡的有益菌，它能够促进肠道有益菌群（双歧杆菌，乳酸杆菌等）的增殖和发育，抑制肠道内有害菌和腐败菌的生长、繁殖，纠正肠道菌群紊乱，减少肠毒素的发生；能产生B族维生素、维生素K、丁酸等物质，对人体具有保健作用。酪酸菌是一种专性厌氧芽孢杆菌，由于它具有耐热耐酸及对常用抗菌素有抗性等特点，在临床上广泛应用于治疗各种肠道疾病，是一种较理想的有开发前景的微生态制剂^[3～6]。

制备酪酸菌微生态制剂首先要实现酪酸菌的高密度培养，而其代谢产物对酪酸菌生长的抑制较为严重，因此，找到酪酸菌生长的主要抑制物，有针对性的解除这种抑制^[8]，实现酪酸菌的高密度培养，成为研究和开发酪酸菌微生态制剂的关键。

1　材料与方法

1.1　实验材料和仪器

1.1.1　菌种

酪酸菌（Clostridiun butyricum） ，本实验室保藏菌种。

1.1.2　试剂

药品均为分析纯，水为去离子水。

1.1.3　树脂

使用的所有型号树脂全部来自南开大学化工厂。

1.1.4　主要仪器

高速离心机（北京医用离心机厂） ，722型光栅分光光度计（上海精密科学仪器有限公司） ，GC-7980Ⅱ型气相色谱仪（美国） ，氢火焰离子检测器。

1.2　实验方法

1.2.1　摇瓶发酵培养基

胰蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏3g，葡萄糖5g，氯化钠5g，可溶性淀粉1g，L-半光氨酸盐0.5g，乙酸钠3g，溶于1000ml水中，调pH7.5。

1.2.2　主要代谢产物含量的测定

GC-7980Ⅱ气相色谱仪，外标法。

1.2.3　离子交换吸附丁酸

（1）静态吸附

将1.0g预处理好的树脂放于150ml三角瓶中，加30ml浓度为20g/L的丁酸溶液，于水浴摇床上震荡12小时后，测定上清液中丁酸的含量，并计算出树脂对丁酸的静态吸附量。

（2）动态吸附

称取200g预处理好的树脂，装入离子交换柱。用蠕动泵以一定的流速加入发酵液，定期取样并测定流出液中丁酸的含量，当流出液中丁酸含量与发酵液相同时，停止进样。

2　结果与讨论

2.1　代谢产物对菌体生长的抑制

酪酸梭状杆菌的主要代谢产物为丁酸、乳酸、乙酸等，为了验证哪种物质会对其生长产生抑制，在对数生长期前期时，向100ml培养液中分别加入一定量的丁酸、乳酸或者乙酸溶液，测定其生长状况。

图1　不同浓度的丁酸对酪酸梭状杆菌生长的影响

图2　乳酸对酪酸梭状杆菌生长的影响

图3　乙酸对酪酸梭状杆菌生长的影响

由以上三图可以看出，丁酸在较低的浓度下就能够强烈地抑制酪酸梭状杆菌的生长，而乳酸和乙酸只有在较高的浓度下才会对酪酸梭状杆菌的生长产生抑制。由于酪酸梭状杆菌生产乳酸和乙酸的能力较差，在整个生长过程中产生的乳酸和乙酸的浓度很低，所以可以断定丁酸为酪酸梭状杆菌生长的主要抑制物。

2.2　解除丁酸抑制的途径

2.2.1　添加碳酸钙

图4　碳酸钙对酪酸菌产酸状态的影响

由图4可以看出，碳酸钙可以明显降低发酵液中丁酸的含量，添加碳酸钙可以使发酵液的最高酸度维持在4.23g丁酸/L左右，而在未添加碳酸钙的发酵液中，其最高酸度在5.22g丁酸/L左右。

图5　碳酸钙对菌体生长的影响

由图5可以看出，添加碳酸钙使发酵液中丁酸的含量有所下降，从而使丁酸对菌体生长的抑制作用有所降低。但由于碳酸钙一般沉积在发酵容器的底部，而酪酸菌采用厌氧发酵，发酵过程中为了避免氧气的伤害一般不能搅动，这在一定程度上限制了碳酸钙的作用，使菌浓提高的幅度有限。

2.2.2　离子交换树脂吸附^[7]

2.2.2.1　静态吸附

根据树脂对丁酸溶液与发酵液中丁酸的静态吸附性能的理论研究，从众多树脂种类中筛选出D201×4，S-8，NKA，树脂A，树脂B等8种树脂，以10g/L丁酸溶液作为吸附对象，初步筛选出2种吸附性能较好的树脂： A、B。树脂的静态吸附试验结果如表1。

表1　树脂的静态吸附

2.2.2.2　动态吸附

图6　树脂的动态吸附曲线

发酵液以3 ml/min的流速进柱，每隔一定时间测定流出液的体积，并测出流出液中丁酸的含量，实验结果如图6。吸附完毕，树脂经去离子水冲洗并利用NaOH溶液作为洗脱剂进行洗脱，再生后重复利用。

2.3　发酵液循环利用实验

5L发酵罐发酵液经陶瓷膜过滤，再经过离子交换树脂脱酸后，重新补充新鲜培养基然后打入发酵罐中进行循环使用，取得了较好的效果。5L罐发酵液脱酸补料循环利用实验与传统的5L罐补料发酵实验比较，大大降低了发酵液中丁酸对酪酸菌生长的抑制，大幅度提高了菌体浓度。

表2　5L罐发酵实验比较

3　结论

实验证明，代谢产物丁酸是酪酸梭状杆菌生长的主要抑制物，消除丁酸的抑制作用是实现酪酸梭状杆菌高密度培养和进一步开发酪酸菌微生态制剂的关键。传统的向发酵液中添加碳酸钙的方法虽然可以使发酵液中丁酸的最高含量有所下降，使丁酸对菌体生长的抑制作用有所降低，但菌浓提高的幅度有限。利用离子交换树脂吸附发酵液中的丁酸，消除丁酸对酪酸菌生长的抑制，使发酵液的重复循环利用成为可能，为实现酪酸菌的高密度培养创造了条件。

5L发酵罐实验表明，发酵残液经陶瓷膜过滤，再经过离子交换树脂脱酸后，重新补充新鲜培养基打入发酵罐中进行循环使用，大大降低了原发酵液中丁酸对酪酸菌生长的抑制，大幅度提高了菌体浓度。

参考文献：

[1]张惠云.微生态制剂的应用及发展前景.畜禽业，2000，（7） :35

[2]李雅林，牛钟相，等.微生态制剂的研究进展.山东畜牧兽医，2000，（6） : 35

[3]王宏地，蔡维国.酪酸菌制剂、帕罗西汀联合治疗肠易激综合征临床观察[J].浙江医学，2000，（7） : 38

[4]朱晓慧，唐宝英，刘佳.酪酸菌制剂活菌检测方法的研究[J].中国微生态学杂志，2000，（2） : 58

[5]张响英，唐现文.微生态制剂在动物生产中的应用.饲料博览，2000，（11） : 33

[6]叶成远，张惠云.微生态制剂在水产养殖中的应用.饲料工业，2000，（3） : 32

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