里氏木霉菌株的中子诱变

时间：2023-10-11 百科知识版权反馈

【摘要】：本实验主要是利用深圳大学的微型核反应堆产生的热中子对里氏木霉QM9414进行诱变，验证微型反应堆产生的热中子对菌体的诱变效果。本实验是通过把里氏木霉QM9414的孢子制成悬浮液，放入样品盒内，利用气压送进微型反应堆的辐照座中进行中子诱变的。

里氏木霉菌株的中子诱变

余少文　陈建星　赵海歌

（深圳大学生命科学学院深圳市微生物基因工程重点实验室　深圳　518060）

摘要：采用微型核反应堆产生的热中子对产纤维素酶的菌株—里氏木霉QM9414进行诱变，通过添加了抑制菌丝生长的去氧胆酸钠的CMC平板进行筛选；得到了4株CMC酶活明显提高的诱变株，其中QM4的CMC的酶活为205.832U/g，比原始菌株QM9414的最高CMC酶活168.716U/g，提高了22%。实验表明微型核反应堆的热中子对产纤维素酶菌株有一定的诱变作用，可作为得到新菌种的一种诱变方式。

关键词：里氏木霉；纤维素酶；微型核反应堆；中子诱变

石油紧缺是现今世界面临的一个首要能源危机，越来越多的国家和地区采用了乙醇汽油来减少对石油的利用。生产乙醇除了传统的粮食发酵外，还可利用产纤维素酶菌株分解纤维素产生葡萄糖，再利用酵母发酵生产出乙醇。这样人们就可以利用自然界中最丰富的能源物质-植物纤维素来缓解石油紧缺的压力。但这项技术最大的难点在于提高纤维素酶分解纤维素的效率，降低生产成本。这就要求发展一个具有高酶活、生产成本低的新菌种。

诱变育种是得到新菌种最常用的方法之一。而亚硝基胍、紫外线、γ射线等是诱变育种最常用的诱变源。这些诱变源的诱变效果已经过多种实验进行验证。中子是原子核的组成部分、是不带电荷的粒子，不直接产生电离，但能使吸收中子的物质的原子核射出质子来，因此由中子产生的生物学效应，几乎完全是由质子造成的，能使生物体产生宽的变异频谱和高突变率，且子代能长期稳定^[1]。中子分为快中子和慢中子，慢中子能量小于0.5Mev，小于0.025 Mev的中子称为热中子，快中子能量为0.5Mev～1 Mev。现有的利用中子进行诱变的案例，大都是用离子加速器产生快中子对农作物种子进行诱变，得到了一些新的农作物品种。利用中子对菌体进行诱变的报道较少，对产纤维素酶菌株的报道更是未见^[2，3，4]。

本实验主要是利用深圳大学的微型核反应堆产生的热中子对里氏木霉QM9414进行诱变，验证微型反应堆产生的热中子对菌体的诱变效果。深圳大学的微型反应堆建于1988年11月，是中国国内建立的第一座研究用的微堆。它利用轻水作为慢化剂与冷却剂，金属铍用作径向及顶部、底部反射层，与用铀铝合金作为堆芯的燃料元件构成临界质量很小的核反应装置^[5]。其实验装置中最大热中子通量为1×10¹²n/cm².s，样品盒内γ与中子的比为10^-6R/h/nv。本实验是通过把里氏木霉QM9414的孢子制成悬浮液，放入样品盒内，利用气压送进微型反应堆的辐照座中进行中子诱变的。里氏木霉QM9414在中子通量为5 ×10⁹n/cm².s下照射20分钟，利用CMC平板筛选得到了一株CMC酶活提高了22%的新菌株QM4。

1　材料与方法

1.1　菌种

里氏木霉QM9414 （微生物研究所提供）

1.2　中子源

微型反应堆（深圳大学核技术研究）

1.3　培养基

PDA培养基：土豆汁20% （用200g土豆煮，先加一小部分水煮，煮烂后纱布过滤，定容至1000ml），葡萄糖10g，琼脂15～20g。

CMC筛选平板： CMCNa 20g，Na₂HPO₄ 2.5g，KH₂PO₄ 1.5g，蛋白胨2.5g，去氧胆酸钠1g，琼脂20g。

固体发酵培养基：稻草粉∶麸皮＝2∶1，1.7%硫酸铵溶液，固液比＝1∶2 （稻草粉先经1%的NaOH和H₂O₂泡1小时后，水洗至中性后使用）。取2.5g固体混合物于250ml三角瓶中，加入5ml1.7%硫酸铵溶液，搅拌混合。灭菌后接孢子悬浮液1ml、29℃培养。

1.4　诱变流程

出发菌株PDA平板培养-制备孢子悬浮液-诱变处理-CMC平板筛选-挑选水解圈直径与菌落直径比大的菌株转PDA平板培养-转固体发酵进行复筛

1.5　纤维素酶活力测定方法

1.5.1　葡萄糖标准曲线

取烘干至恒重的无水葡萄糖，配成1mg/ml的葡萄糖溶液，准备7支试管分别加入0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2ml的葡萄糖溶液，补加水至2ml，加2mlDNS，沸水中显色10分钟，540nm测吸光值。3次重复实验的均值用最小乘法拟和y=ax+b一元线性回归方程。

1.5.2　CMC酶活力

称0.5g固体发酵物溶于50mlpH4.8的醋酸—醋酸钠缓冲溶液中，再1ml上清液溶于3mlpH4.8的醋酸—醋酸钠缓冲溶液中，制成1∶200的稀释酶液。然后取0.2ml稀释酶液加1.8ml1%CMC溶液（空白样直接加2mlDNS），加塞后50℃水浴30分钟，然后沸水浴10min，加2mlDNS，沸水浴10分钟，540nm测吸光值。

1.5.3　FPA酶活力

称0.5g固体发酵物溶于50mlpH4.8的醋酸-醋酸钠缓冲溶液中，再1ml上清液溶于2mlpH4.8的醋酸—醋酸钠缓冲溶液中，制成1∶150的稀释酶液。然后取0.2ml稀释酶液加1.8mlpH4.8醋酸—醋酸钠缓冲液，加塞后50℃水浴30分钟，然后沸水浴10min，加2ml DNS，沸水浴10分钟，540nm测吸光值。

1.5.4　酶活力单位

每克固体发酵物在50°pH4.8条件下，每分钟水解底物产生1umol还原糖的酶量定义为1个酶活力单位，记作U/g。

2　结果与讨论

里氏木霉QM9414的孢子悬浮液在中子通量为5 x10⁹n/cm².s下照射20分钟后，稀释涂布CMC筛选平板，挑选出水解圈直径与菌落直径比未诱变菌株大的菌株共5株，通过固体发酵最高酶活比较，测得CMC酶活有4株提高，分别命名为QM1、QM2、QM3、QM4（见图1）。但其相应的滤纸酶活力则提高不多，甚至略有下降（见图2）

从以上结果可知微型反应堆的热中子对产纤维素酶菌株的酶活力有一定的促进作用。筛选得到的4株CMC酶活明显提高的突变株的滤纸酶活变化不大，应该是与采用CMC平板筛选相关，因此筛选菌株主要是集中在CMC酶活力的提高，即筛选菌株的变异主要集中在β-1，4-葡聚糖活力（CMC酶活力）上。如要筛选得到滤纸酶活提高的突变株，可考虑采用滤纸条筛选的方法。

图1　固体发酵最高CMC酶活比较

图2　固体发酵最高滤纸酶活比较

从CMC平板上初筛出来的变异株也只有5株，筛选率过低，但这并不表示微型反应堆的热中子引起的正突变率低，造成初筛菌株少的原因，主要是由于QM9414的高酶活影响，致使其在CMC平板上的水解圈太大（见图3），大部分水解圈都超过了20mm，使得多个单菌落的水解圈重叠，影响了筛选。当然也可采用点接法，用牙签将无法观察到水解圈大小的单菌落转移到新的CMC平板上进行筛选，这是下一步将进行的工作。