绿色木霉纤维素酶高酶活菌株的诱变选育(1)
岳思君1,2 苏建宇1 李爱华1,2 王锦1
(1.宁夏大学生命科学学院银川750021; 2.宁夏大学饲料工程中心 银川 750021)
摘要:利用亚硝酸盐-紫外线复合诱变处理绿色木霉菌株,选育出透明纤维素水解圈大的高产纤维素酶的突变菌株T5。用DNS法测定该变异菌株,CMC酶活力为0.1809IU,FPA酶活力为0.1110IU,C1酶活力为0.0859IU。结果表明菌株T5纤维素酶活力比出发菌株有显著提高,而且产酶稳定。
关键词:绿色木霉,纤维素酶,酶活力,复合诱变
自然界中有机固体废弃物一半以上的成分是纤维素和半纤维素。如果把纤维素和半纤维素转化成葡萄糖,这对于缓解世界粮食危机,改善人类生活水平以及固体废弃物资源化具有不可估量的价值[1]。在发酵工业上利用木质纤维素的路线有两条,一是物理法预处理酶解、发酵;二是酸解、发酵。由于酸解对工艺条件和生产设备要求苛刻,成本高昂,至今未能在发酵工业中形成规模。目前,对纤维素的降解利用主要采用生物手段,即利用纤维素分解菌或其产生的酶来降解纤维素,这样,分离和筛选高效降解纤维素菌的工作就显得尤为重要。利用里氏木霉,绿色木霉等真菌纤维素酶产生菌生产纤维素酶,可分解经过处理的纤维素类材料并达到良好的效果[2]。真菌纤维素菌纤维素酶系主要由下类酶组成: (1)葡聚糖内切酶(EG) ,又称Cx酶或CMC酶。一般作用于纤维素内部的非结晶区,随机水解β-1,4-糖苷键,产生大量带非还原性末端的小分子纤维素。 (2)葡聚糖外切酶(CBH) ,又称C1酶或微晶体纤维素酶。作用于纤维素线状分子末端的β-1,4-糖苷键,每次切下一个纤维素二糖分子。 (3) β-葡聚糖苷酶(BG) ,又称纤维素二糖酶。一般将纤维二糖水解成葡萄糖。在分解纤维素的反应中,前两种酶起主要作用,而纤维素二糖酶将纤维二糖水解成葡萄糖分子。虽然已对纤维素无作用,但亦可以消除上述两种酶催化反应的终产物对反应的抑制作用,从而加快反应速度[3]。
纤维素酶在食品、酿造行业、农副产品深加工、饲料、医药、环境保护和化工等领域有着非常广阔的应用前景和应用潜力[4]。尽可能提高菌株产纤维素酶的能力一直是各国科研工作者努力攻关的项目之一。我国对纤维素酶的研究和生产也已开展了较为广泛的研究[5]。本研究以降解纤维素的绿色木霉(Trichoderma viride)为出发菌株,对其进行了亚硝酸盐-紫外线复合诱变处理,最终获得了纤维素酶活性显著提高的突变菌株。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 菌种
绿色木霉由宁夏大学饲料工程中心实验室保藏。
1.1.2 培养基
斜面培养基:马铃薯200克,蔗糖20克,琼脂20克,水1000ml。
诱变后初筛培养基: (NH4)2SO4 1g,MgSO4 0.25g,K2HPO4 0.5g,NaCl 0.25g,CMC-Na 1g,琼脂10g,水500ml,pH值自然,121℃灭菌20min。
产酶固体培养基:培养基为玉米秸秆粉,麦麸分别占60%和40%.按1∶1.6质量比加入营养液.121℃灭菌30min。
1.1.3 滤纸的预处理
将大块滤纸剪成直径近于培养皿大小的圆形,用体积分数为1%的醋酸浸泡一昼夜除去淀粉,用碘液检验,再用体积分数为2%的NaHCO3洗至中性,晒干待用。
1.2 方法
1.2.1 培养方法
斜面培养:将保藏菌种接种到PDA斜面培养基上进行活化培养。其培养温度为28℃,自然pH值,培养3d,制成菌种斜面,保存在冰箱中备用。
产酶固体培养:向试管中加入10ml无菌水洗下斜面上的孢子制成其孢子悬液,保证其孢子浓度为108个/ml以上即可。取孢子悬液1ml接种于固体产酶培养基上,培养在28℃恒温箱中培养3d。
1.2.2 诱变处理方法
1.2.2.1 处理流程
斜面菌种→孢子悬液→稀释计数→亚硝酸盐处理→紫外线处理→稀释涂布培养→初筛→挑中单菌落传种斜面→固体发酵培养→测定菌株酶活力。
1.2.2.2 诱变前培养及孢子悬液的制备
将出发菌种接种于PDA培养基上,培养5d制得斜面。加入无菌水5ml振荡制成孢子悬液,稀释后孢子浓度为3.5×107个/ml。冰箱保存备用。
1.2.2.3 亚硝酸盐诱变[6]
取出发菌株孢子液2.0ml于培养皿中,向其中加入0.1mol/l NaNO2溶液1.0ml混匀,28℃保温5min,加入0.1mol/l醋酸-醋酸钠缓冲液1.0ml,28℃保温10min,再加入2.0ml pH值8.6的Na2HPO4中和。
1.2.2.4 紫外线诱变处理[6]
取亚硝酸盐处理后的孢子悬液置于磁力搅拌器上,用30w紫外灯,相距30cm照射10min后打开培养皿盖,开始照射。在照射处理开始的同时打开磁力搅拌器进行搅拌,照射时间为10min。
1.2.3 变异菌种的筛选方法
平板筛选:取复合诱变后的孢子悬液在红灯下吸取0.1ml涂布于初筛培养基上,28℃培养3d。用4g/L刚果红染色5min,倾去染液,测透明圈直径。透明圈大的说明其产酶活力高,将其挑出。每个培养皿中筛选出透明圈较大的两个菌株进行斜面扩大培养和发酵产酶培养。斜面扩大培养和发酵产酶培养的培养条件和方法同1.2.1的培养方法。
1.2.4 粗酶液制备
在培养第3d时取样,将样品在4℃,4000r/min条件下离心分离15min,取上清液作为粗酶液。
1.2.5 酶活力的测定
1.2.5.1 CMC酶活力测定[7]
取4支带有20ml刻度的试管,1支管作空白对照管,3支管作平行样品管。移取酶液0.5ml于试管中,加入含0.5% CMC-Na的柠檬酸缓冲液(0.05mol/L,pH4.4) 1.5ml,然后在50℃水浴锅中准确作用30min后,立即按3,5-二硝基水杨酸(DNS)法测定糖,以国际单位为依据,定义每1min催化纤维素水解生成1μmol葡萄糖的酶量为一个酶活力单位“IU” 。
1.2.5.2 滤纸酶(FPA)活力测定[7]
取4支带有20ml刻度的试管,1支管作空白对照管,3支管作平行样品管。将新华1号滤纸卷成小卷,放进平行管内,空白管中不加滤纸。向3支平行管中加入3.0ml乙酸-乙酸钠缓冲液(pH值为4.8) ,再加入1ml粗酶液,轻轻摇匀,使滤纸完全浸泡在液体中,50℃保温1h。按3,5-二硝基水杨酸(DNS)法测定糖。酶活力单位定义同1.2.5.1。
1.2.5.3 C1酶测定[8]
取4支带有20ml刻度的试管,1支管作空白对照管,3支管作平行样品管。向各试管中均加入0.2ml粗酶液,再加入pH4的醋酸缓冲液1.8ml,取其中3支作为测定管,各加一个50mg的棉球,充分浸泡后置50℃恒温水浴锅1h。按3,5-二硝基水杨酸(DNS)法测定糖。酶活力单位定义同1.2.5.1。
2 结果与分析
出发菌株编号为T0,把经过复合诱变菌株编号T1~T8,其诱变后纤维素酶活力结果如表2,诱变前后纤维素酶活力差异显著性比较如表3。
表2 诱变前后菌种酶活力的对比(IU/ml)
由于突变是不定向的,具有不可控制性。所以经过复合诱变后,成功得到了几株纤维素酶活力显著提高的菌株,并且其中大部分突变菌株的C1,CX,FPA三种酶活力显著提高,但其中也有几株出现了负向突变。
由表2可以得出诱变前后菌株酶活力的提高比率:诱变后CMC (CX)酶活力提高率最高的菌株T5比出发菌株T0提高了82.3%,提高率最低的菌株T4也提高了5.9%; C1酶活力提高率最高的菌株T5比出发菌株T0提高了1.2倍,提高率最低的菌株T4也提高了1.5%; FPA酶活力提高率最高的菌株T5比出发菌株T0提高了86.9%,提高率最低的T6提高了4.12%。
表3 诱变前后纤维素酶活力差异显著性比较
注:相同字母表示差异不显著,不同的字母表示差异显著用DPS统计软件处理试验数据
由表3可以看出:在CMC酶活力中,菌株T5、T1、T4、T2、T7与菌株T0比较均有显著差异;在FPA酶活力中,菌株T5、T2、T3、T7与菌株T0比较均有显著差异;在C1酶活力中菌株T5、T2、T7与菌株T0比较均有显著差异。从结果中可以看出,菌株T5、T2、T7就是选育出的菌株。其中菌株T5是选育出的最理想的突变菌株,其CMC酶活力比出发菌株提高了82.3%,FPA酶活力比出发菌株提高了86.9%,C1酶活力比出发菌株提高了1.2倍。
3 讨论
3.1 目前不同诱变剂的作用效果有不完全叠加性和协同性,所以不断变换诱变剂的效果比单一诱变剂的效果好,即复合诱变比单一因子诱变的效果好。在复合诱变中,先经亚硝酸后经紫外线诱变的菌株的产酶能力明显提高,同时菌落的生长速度也明显加快[9]。本实验采用了复合诱变的方法,使诱变后的大部分菌株纤维素酶活力有了明显的提高。
3.2 诱变处理只是增加了突变的几率,从经过诱变处理的微生物群体中分离筛选所需要的高产菌株,要进行大量细致的鉴定工作。本实验采用的是纤维素水解圈鉴定法和固体发酵培养测定酶活力。有资料表明水解圈鉴定法是通过菌落周围培养基水解圈的大小判断菌株的产酶能力,水解圈越大,产酶越多;水解圈出现得越早,产酶越快[10]。由实验可知,诱变后菌株T5水解圈最大,其相应的纤维素酶活力就高。其他的菌株也都基本符合这个规律。然而,虽然透明圈大小直接反映了酶浓度的高低,但不能完全代表菌株产酶能力,对此Teather和Wood[11]指出液体样品的酶浓度与透明圈的直径成线性关系,可以对酶活进行初步定量。因而仅以水解圈大小作为菌株产纤维素酶活力大小的唯一定量指标是不太可靠的,所以发酵复筛必不可少。
参考文献:
[1]卢维德.纤维素的生物降解及纤维素酶的提取[J].湖南与微生物学通讯,1989,(1) :47~50
[2]张继泉,王瑞明,孙玉英,等.里氏木霉生产纤维素酶的研究进展[J].饲料工业,2003,24 (1) :9
[3] Rabinovch ML,mlnic MS,Bolobova A V. The structure and mechanism of action of cellulolytic enzymes [J]. Biochemistry,2002,67 (8) :850~857
[4]玛克宽,王明谊.黑曲霉sla -122菌株产纤维素的[J].西北师范大学学报,1991,27 (1) : 61
[5]曾文青,刘蓉,曾勤.纤维素酶系高产菌株的选育[J].四川省卫生管理干部学院学报,2000,19 (1) :4
[6]杜连祥,等.工业微生物实验技术.天津:天津科学技术出版社,1992.172~173
[7]郭杰炎,蔡武城.微生物酶[M].北京:科学出版社,1986
[8]袁勤生,赵健.酶与酶工程[M].上海:华东理工大学出版社,2005
[9]叶姜渝.一种纤维素分解菌鉴别培养基[J].微生物学通报,1997,24 (4) :251~ 252
[10]范琳,牛艳芳,房耀维.高产纤维素酶菌株的诱变选育研究[J].内蒙古师范人学学报自然科学(汉文)版,2004,33 (2) :195~198
[11] Ronald M Teather and PeterJ Wood.Use of congored Polysaccharide interaction in enumeration and characterization ofCellulilytic bacteria fromthe bovine rumen[J]1Appl.Environ. Microbiol,1982,38:148~1581
【注释】
(1)基金项目:国家“863”计划项目(2005AA0013330) ;宁夏大学自然基金重点项目(2004-029)
免责声明:以上内容源自网络,版权归原作者所有,如有侵犯您的原创版权请告知,我们将尽快删除相关内容。