石蜡节杆菌生产-鸟氨酸发酵培养基和工艺条件优化

石蜡节杆菌生产L-鸟氨酸发酵培养基和工艺条件优化

黄爱清¹　苏国成²　王璋¹

（1.中国食品发酵工业研究院北京100027； 2.集美大学生物工程学院　厦门　361201）

摘要：在确定了发酵种子条件，得出了最适种子培养基、种龄与接种量的基础上，采用正交设计与均匀设计试验方法，并利用DPS数据处理软件对实验结果进行统计分析，对于石蜡节杆菌WZFF.X-Orn0602菌株发酵生产L-鸟氨酸的最适发酵培养基配方和批式发酵生产工艺条件进行优化操作。结果表明，DPS软件在L-鸟氨酸发酵培养基优化方面取得良好的效果，确定了最适发酵培养基的组分及配比，优化了发酵培养条件。在优化工艺条件下该石蜡节杆菌产酸水平达到13.64g/L，提高了56.4%。

关键词： L-鸟氨酸发酵，石蜡节杆菌，培养基优化，实验设计，DPS数据处理系统

L-鸟氨酸是微生物L-精氨酸生物合成途径上的一种重要中间产物，是哺乳动物尿素循环中的主要代谢物质，在解“氨毒”过程中起着重要的作用。因此，在医药上用于配制保肝、护肝以及治疗一些急性肝炎、慢性肝功能障碍等疾病的医药制剂或注射输液。Kinoshita等^[1]在1957年首先发表利用瓜氨酸缺陷型突变株发酵生产L-鸟氨酸，这一成功事例在一定意义上开创了利用营养缺陷型突变菌发酵生产氨基酸的先河^[2]。但出于对技术产权的保护，绝大分部分L-鸟氨酸发酵生产研究均以专利的形式发表，这在一定程度上给后来研究利用微生物发酵法生产L-鸟氨酸的研究人员带来更大的困难与挑战。

众所周知，氨基酸发酵是典型代谢控制发酵，L-鸟氨酸也不例外，L-鸟氨酸生物合成途径中的酶均受到L-精氨酸的反馈调节，而且微生物对菌体细胞内的代谢产物的合成均遵循“细胞经济”理论，本研究室基于代谢控制育种策略，经NTG、DES诱变与驯化培养等措施选育出一株L-鸟氨酸生产菌，摇瓶发酵初步测试结果显示，在发酵条件并未优化的情况下具有明显的产酸能力，说明该菌株在一定程度上脱离“细胞经济”的束缚，能够过量合成L-鸟氨酸。然而，菌株产酸率的高低不仅仅取决于菌种活力的大小，还与培养基（包括保藏培养基、种子培养基以及发酵培养基等） 、发酵设备和发酵培养条件（如pH、温度、转速、通风量等）等因素密切相关。 L-鸟氨酸发酵条件主要包括两方面的内容：一是培养基的优化，包括种子培养基和发酵培养基；二是发酵环境的优化，包括温度、转速和装液量。本研究根据所需考虑的因素及其水平数的多少，选择了正交设计^[3]、均匀设计^[4]等相应的试验设计方法，实验数据均是使用DPS数据处理系统（Data Processing System）分析软件^[5]进行处理，从而优化L-鸟氨酸种子与发酵培养基成分以及发酵培养条件，在提高菌种发酵能力方面取得较好的效果，为下一步工业化发酵生产试验奠定扎实有益的基础。

1　材料与方法

1.1　菌种

石蜡节杆菌（Arthrobacter paraffineus） WZFF.X-Orn0602 （Cit^-+Pro^-+SG^r+D-Arg^r），本实验室经诱变所得、保藏。

1.2　主要培养基

1.2.1　活化斜面培养基（g/L）

葡萄糖10，酵母膏2.5，牛肉浸膏5g，蛋白胨5，氯化钠2.5，pH值7.0。

1.2.2　基础种子培养基（g/L）

葡萄糖30，硝酸铵15，酵母膏5，KH₂PO₄· 3H₂O 1.5，MgSO₄· 7H₂O 0.5，ZnSO₄· 7H₂O 0.4，MnSO₄· H₂O0.4，pH7.0。

1.2.3　基础发酵培养基（g/L）

葡萄糖100，硝酸铵30，酵母膏5，KH₂PO₄· 3H₂O 2，Na₂HPO₄2，MgSO₄.7H₂O 1，生物素100μg，pH 7.0。

1.3　L-鸟氨酸生产

1.3.1　种子液培养

取一环石蜡节杆菌斜面保藏培养物接种于活化斜面培养基，30℃恒温培养24h后，转接于装有30ml种子培养液的250ml三角瓶中，30℃、120 r/min振荡培养，采用浊度法测定种子生长曲线，确定种子液达到对数生长中后期的培养时间。

1.3.2　摇瓶发酵

取适量上述发酵种子液按一定比例转接于装有适量的发酵培养基的500 ml三角瓶中，在合适的培养条件下振荡培养，从第1d开始连续进行L-鸟氨酸含量、菌体细胞干重（DCW） 、pH等的测定。

1.3.3　小型生化反应器发酵产酶试验

利用本实验室自行设计的2L小型生化反应器^[6]，发酵培养基装量为1 400 ml。种子液培养后以10%比例接入，搅拌速度200 r/min，通气量约850 ml/min，30℃下培养发酵产酸，定期分析产酸量和菌体量等的变化。

1.4　分析方法

L-鸟氨酸的测定采用本实验室建立的方法^[7]进行，葡萄糖的测定采用3，5-二硝基水杨酸法^[8]，生物量的测定以DCW法^[9]，pH值采用pH计测定。

2　结果与分析

2.1　种子培养基的优化

根据菌种X-Orn0602的特性，本实验采用L₉3^（4）正交表，选择葡萄糖、硝酸铵、酵母膏三个因素，分别取三个水平，其他种子培养基成分不变。将X-Orn0602接种于不同种子培养基中，培养至对数生长末期，然后转接于基础发酵培养基中进行发酵产酸实验，振荡培养72h后测定发酵液中的L-鸟氨酸浓度，每组实验重复3次，正交实验方案及结果表1。采用DPS数据处理系统软件对表1中实验数据进行分析，其结果见表2。

表1　正交实验方案及结果

表2　正交实验分析结果

由表2的极差分析结果可以看出，葡萄糖（A） 、硝酸铵（B）与酵母膏（C）三个因素对菌种产酸率的影响大小依次是葡萄糖、酵母膏与硝酸铵，各自优先水平分别为A2 （30g/L） 、B3（20g/L） 、C2 （5g/L） 。另由正交实验方差分析结果可知，葡萄糖、硝酸铵与酵母膏对菌种产酸率均有显著影响，其影响差异大小与极差分析结果一样，依次是葡萄糖、酵母膏与硝酸铵。因此，由正交实验所优化得出的最佳种子培养基组成（g/L）是：葡萄糖30，硝酸铵20，酵母膏5.0，K₂HPO₄· 3H₂O1.5，MgSO₄· 7H₂O0.5，ZnSO₄· 7H₂O0.4，MnSO₄· H₂O0.4，pH7.0。

2.2　种龄和接种量的确定

实验先采用浊度法测定种子生长增值曲线，如图1所示，菌种培养进行到16～18h时，X-Orn0602菌株处于对数生长末期，所以可以选择种龄为16～18h。

图1　X-Orn0602菌株种子培养生长曲线

图2　不同接种量对产酸率的影响

将培养16～18h的新鲜种子液按2.5%、5%、7.5%、10%、12.5%的接种量分别接入基础发酵培养基中，实验结果如图2所示。从图2可知，最适接种量为5%。

2.3　最适发酵培养基的确定

有报道，石蜡节杆菌除了能利用葡萄糖外，还可以利用果糖、甘露醇、石蜡以及醋酸等氮源用于菌体生长繁殖。因此，实验除了研究了葡萄糖、果糖与石蜡对菌株X-Orn0602发酵产酸的影响外，还考虑了土豆淀粉、麦芽糖以及蔗糖的影响。除了土豆淀粉按15%添加，其他碳源以基础发酵培养基中10%葡萄糖的含碳量折算后加入到发酵培养基中，实验结果如图3所示。

图3　不同碳源对菌株X-Orn0602生长与产酸的影响

图3显示，所测试的六种碳源中，葡萄糖最适合于菌株X-Orn0602产酸及生长，其产酸率和DCW分别达到8.76g/L和12.6mg/ml；其次是果糖，产酸率为5.36g/L，DCW为9.21mg/ml。菌株X-Orn0602对石蜡的利用率较低，或许是由于经过诱变后，该菌株利用石蜡的某些酶系已经改变。可见，葡萄糖是菌株Orn0602生长与产酸的最适碳源。

最适氮源的选择中，由于菌体生长与合成目的产物需要大量的氮源，因此本实验优先考虑菌株X-Orn0602对无机氮源的利用情况，以此来确定一种合适氮源来用于菌株X-Orn0602生长及产酸。主要考虑的硝酸铵、硫酸铵、氯化铵和尿素等四种无机氮源的影响。硝酸铵、硫酸铵、氯化铵和尿素的初始添加量均为30g/L，实验结果如图4所示。

图4　不同氮源对菌株X-Orn0602生长与产酸的影响

由图4可知，硫酸铵比较适合于菌株X-Orn0602生长与产酸，略优于硝酸铵。根据相关文献报道^[10～11]，L-鸟氨酸发酵与菌体生长呈正相关，因此，在硫酸铵和硝酸铵这两种无机氮源之间，优先选择硫酸铵。

另外，在本实验中未考虑的有机氮源（如酵母膏、蛋白胨、大豆水解物等）则主要培养基综合优化时作为一种营养添加因子方面将加以考察。

同时，采用6因素10水平10组试验方案U10^*（10⁸）均匀表^[4]，综合考察葡萄糖、硫酸铵、酵母膏、大豆蛋白胨与K₂HPO₄ （以K₂HPO₄· 3H₂O计）浓度配比对菌株X-Orn0602产酸的影响，各成分水平安排见表3，其他培养基组分按照基础发酵培养基中比例添加。将上述六种组分的水平安排按照均匀设计表U10^*（10⁸）排列，最终实验结果如表3所示。采用DPS数据处理系统软件多因子及平方项逐步回归分析，结果如表4所示。

表3　均匀设计实验结果

X₁葡萄糖、X₂硫酸铵、X₃K₂HPO₄、X₄酵母膏、X₅大豆蛋白胨、X₆尿素。

表4　均匀设计逐步回归分析结果

并得出回归模型优化表达式：

　　Y=3.753204+0.0634105563X₁-0.566929492X₃-0.1718168450X₄

　　　-2.633467087X5-0.000944248998X₂²　　　　　+0.0677910021X₃²

　　　+0.465742311X₅²+0.0362562286X₆²

其相关系数R=0.99998，总体显著性检验值F=3519.806，显著水平达到P=0.013，剩余标准差S=0.01602，因此该方程的可信度高。

修改变量初始值，并满足如下几个约束条件： （X₁-100） （X₁-160） /160<0，（X₂-10） （X₂-55） / 55<0，（X₃-1） （X₃-5.5） /5.5<0，（X₄-2.5） （X₄-7） /7<0，（X₅-1） （X₅-3.25） /3.25<0和（X₆-5）（X₆-11） /11 <0，用非线性规划对回归方程进行优化求解，得出回归方程的实际最优解： X₁（葡萄糖）＝150，X₂ （硫酸铵）＝30，X₃ （K₂HPO₄）＝1.5，X₄ （酵母膏）＝5.5，X₅（大豆蛋白胨）＝1.0，X₆ （尿素）＝7.0。将上述最优值代入方程（4.1） ，得到Y最大预测值为10.38g/L。

根据回归分析所得出的上述六种培养基组分实际最优值重新配置发酵培养基进行发酵测试，结果见如表5。

表5　优化实验测试结果（g/L）

由表5测试结果可知，实测平均值为10.49g/L，与模型预测值10.38g/L相差不大。通过假设检验分析^[12]可知，T=0.8630 < t_0.05 （4） =2.776，因此可知实测平均值与模型预测值没有显著差异，这进一步说明回归方程可信度高。因此，发酵培养基中的葡萄糖、硫酸铵、K₂HPO₄、酵母膏、大豆蛋白胨与尿素含量（g/L）分别是150、30、5.5、1.0与7.0。

2.4　发酵培养基初始pH值对产酸的影响

根据石蜡节杆菌最适生长pH值范围，选择发酵培养基初始pH分别6.0、6.5、7.0、7.5和8.0时对菌株生长与产酸的影响，实验结果在表6显示。不同的初始pH值对菌体生长影响不大，但对菌株产酸有较大影响，初始pH为7.0时，最适合于菌株生长与产酸。

表6　初始发酵pH值对菌株X-Orn0602产酸的影响

表7　温度对菌株生长与产酸的影响

2.5　培养温度的影响

本实验根据石蜡节杆菌的生长温度范围，考察发酵温度对菌株X-Orn0602生长与产酸的影响，结果如表7所示。表7显示，当发酵温度为30℃时，菌株X-Orn0602既有较好的生长状态，又能在发酵液积累大量的L-鸟氨酸。当超过30℃后，菌株生长与产酸均明显降低。因此，可以选择30℃作为发酵培养温度。

2.6　溶解氧的影响

L-鸟氨酸发酵是好气性发酵，溶解氧对发酵有着很大的影响。对于使用特定的发酵培养基在特定的培养温度下进行发酵培养时，溶解氧的因素可以集中于装液量与转速两个方面。本实验考察了采用固定转速（120r/min）情况下，不同装液量对菌株X-Orn0602生长与产酸的影响，结果如图5显示。不同的装液量菌株X-Orn0602生长的影响相对较少，但对菌株产酸有较为明显的差异，最适装液量为30ml/250ml三角瓶。

图5　固定转速下装液量对菌株X-Orn0602生长与产酸的影响

2.7　摇瓶发酵过程曲线的制作

在上述所确定的最适发酵条件下，利用本实验室自行设计的2L小型生化反应器^[6]进行发酵，每间隔一定时间测定发酵液中残糖浓度、菌体浓度（DCW） 、L-鸟氨酸含量后制作的L-鸟氨酸发酵生产过程曲线如图6所示。

图6　L-鸟氨酸发酵生产曲线

由图6可知，0～16h为菌体生长的延滞期，此时菌体耗糖速率较慢，主要用于长菌基本不产酸，32～72h为菌体对数生长期，此时单位细胞的生长速率达到并保持最大值，耗糖速率明显加快，并开始积累L-鸟氨酸； 72～80h期间，菌体进入稳定期，在此阶段菌体耗糖速率较快，L-鸟氨酸大量合成，积累量达到13.64g/L，比优化之前的产酸量8.72g/L提高了56.4%。图6还显示，菌体生长与产酸呈现明显的正相关性，与Choi等人^[11，13]所发表的情况形似。

3　小结

本研究主要就目标菌株X-Orn0602发酵生产L-鸟氨酸的相关条件进行了一定的优化。通过相关的试验设计方法，优化了发酵种子条件和发酵培养条件。

（1）确定了发酵种子条件，得出了最适种子培养基、种龄与接种量。最适种子培养基（g/L） ：葡萄糖30，硝酸铵20，酵母膏5.0，K₂HPO₄· 3H₂O 1.5，MgSO₄· 7H₂O 0.5，ZnSO₄· 7H₂O 0.4，MnSO₄· H₂O0.4，pH7.0；种龄为16～18h；接种量为5%。

（2）确定了最适发酵培养基的组分及配比，优化了发酵培养条件。最适发酵培养基（g/L） ：葡萄糖150，酵母膏5.5，硫酸铵30 ，尿素7.0，大豆蛋白胨1.0，K₂HPO₄· 3H₂O 1.5，MgSO₄· 7H₂O 1.0，MnSO₄· H₂O 0.4，FeSO₄· 7H₂O 0.15，ZnSO₄· 7H₂O 0.8，生物素100μg，pH 7.0；培养温度30℃；在固定转速（120r/min）下，最适装液量为30ml/250ml三角瓶。

（3）确定了L-鸟氨酸发酵过程曲线，菌株X-Orn0602生长与产酸是正相关性，最佳发酵培养时间为80h，最大产酸水平为13.64g/L，菌体生长与产酸呈正相关。

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