-异亮氨酸发酵的溶氧控制与优化

L-异亮氨酸发酵的溶氧控制与优化

杨宁¹　徐庆阳¹　陈宁^1，2

（1.天津科技大学生物工程学院； 2.天津市工业微生物重点实验室　天津　300222）

摘要：利用途径分析方法对黄色短杆菌（Brevibacterium flavum） TC-21生产L-异亮氨酸的途径进行了分析，确定L-异亮氨酸理论最高摩尔产率是1，确定了黄色短杆菌生产L-异亮氨酸的最佳途径的通量分布并以此为依据进行发酵溶氧控制优化，通过溶氧分阶段控制发酵生产L-异亮氨酸比溶氧恒定控制方式发酵产率提高了15.77%。实验结果说明途径分析方法可以用于指导L-异亮氨酸发酵。

关键词： L-异亮氨酸；途径分析；溶氧控制；黄色短杆菌

L-异亮氨酸（L-Ile）是人体八种必需氨基酸之一，同时又是三种分支链氨基酸之一，在人类生命代谢中占有特别重要的地位。作为典型的代谢控制发酵，Ile的发酵控制尤为重要。近年来，代谢工程研究方兴未艾，为人们提供了新的研究方法。工业微生物学家试图通过对细胞进行遗传修饰来改变生物过程的运行，以实现目的产物的过量合成，这就需要对代谢网络进行理性的分析。代谢途径的确定对于提供一个以整个代谢功能和表型为出发点进行途径定位的方法是必不可少的。途径分析（Pathway analysis）是代谢工程中用以指导遗传操作的理论基础，是代谢网络分析的基本方法。代谢途径的结构分析用到了关于计量学模型和可逆性或非可逆性反应的知识，然后通过计算就能得到最优途径的通量分布。这已经通过计算机程序得到实现。

本文以途径分析理论为指导，确定了黄色短杆菌由葡萄糖生产L-异亮氨酸的最佳途径。根据途径分析的结果确定改变溶氧的方法来改变细胞内部的代谢流分布，使其在一定环境下生成更多的产物。

1　材料和方法

1.1　供试菌株

黄色短杆菌Brevibacterium flavum TC-21（Met^-+Eth^r+ α-AB^r+ AEC^r） ，天津科技大学代谢控制发酵研究室保藏菌种。

1.2　培养基（g/L）

斜面培养基：葡萄糖1，酵母膏5 ，蛋白胨10，氯化钠2.5琼脂20，pH 7.0～7.2。

种子培养基：葡萄糖30，KH₂PO₄1.5，MgSO₄0.4，FeSO₄0.01，MnSO₄0.01，（NH₄）₂SO₄3，尿素2，豆饼水解液20，VH 0.5mg/L，VB1 2.5mg/L，pH 7.0～7.2。

发酵培养基：葡萄糖70 ，（NH₄）₂SO₄15，FeSO₄15 mg，MgSO₄500mg/L，MnSO₄15mg/L，KH₂PO₄1.5，K₂HPO₄3，V_H140μg/L，V_B10.1mg/L，Met 20 mg/L，豆饼水解液20，玉米浆25，pH7.0～ 7.2。

1.3　培养方法

种子培养：接一环生长良好的斜面种子至装有25ml种子培养基的500ml摇瓶中，置于旋转式摇床上（200r/min） ，31℃振荡培养38h。

发酵：按15%接种量将种子液接入5L自动控制发酵罐中，装液量3L，通风量1～3L/min，根据溶氧控制搅拌转速，培养温度31℃，通过自动流加浓氨水溶液控制pH7.2±0.03，发酵96h。

1.4　分析方法

发酵液中残糖测定：采用SBA-40系列生物传感分析仪测定。

OD值的测定：稀释一定倍数后，在波长620nm处用722分光光度计测定。

pH的测定:采用pH6.4～8.0精密pH试纸测定。

发酵液中氨基酸含量测定：采用氨基酸分析仪测定。

2　结果和讨论

2.1　L-异亮氨酸生物合成途径分析

L-异亮氨酸生物化学反应网络如图1所示。

根据以上代谢网络以及各步反应的化学计量平衡式（见附录） ，可由计算机计算出该代谢可分为9个模型。反应模型中的每个元素代表相应反应的相对代谢流。任何一个基础反应模型都包含一系列无用的反应（用“0”表示） 。任何一个模型的L-异亮氨酸产率都可以由L-异亮氨酸的通量与第一个通量Glc→Glc6P相除来得到，产率最高的基本模型代表了最优途径。最优途径和通量分布见图2。

在模型1和模型2中，由1mol葡萄糖生成1molL-异亮氨酸，产率高达100%。产率最高，见图2。其原因就是PEP直接生成OAA，且葡萄糖由EMP途径进入代谢网络而不通过HMP途径进入代谢网络，从而避免了碳源的浪费。

经途径分析后，一个特殊的代谢路径的所有酶被过量表达时，编码不必要的酶的基因被敲除，就会构建出一个高产的路径。为了避免通过TCA循环和乙醛酸支路生成OAA而造成碳源的浪费，可以通过过量表达PEP羧化激酶的基因直接使PEP生成OAA或过量表达丙酮酸激酶的基因和丙酮酸羧化酶的基因通过Pyr生成OAA。为了避免因生成CO₂而造成浪费，应该对6-磷酸葡萄糖脱氢酶进行节堵。按照途径分析结果，TCA循环和乙醛酸支路应该减弱，但因为细胞生存所需大多数的ATP都是由TCA循环提供的，所以该循环中的酶不能被完全敲除。 TCA流量减少，从而使碳架流转向异亮氨酸的合成，而TCA循环的代谢流量是和发酵溶氧控制紧密相连的，因此发酵中后期控制适当的溶氧对异亮氨酸发酵具有重要意义。

图1　L-异亮氨酸生物化学反应网络

1： Glc→Glc6P； 2： Glc6P→Fru6P； 3： Fru6P→2GAP； 4： GAP→PEP； 5： PEP→Pyr；

6： Pyr→PEP； 7： Pyr→AcCoA+CO₂； 8： AcCoA+OAA→Iso； 9： Iso→αKG+CO₂；

10： αKG→Succ+CO₂； 11： Iso→GA+Succ； 12： GA+AcCoA→Mal； 13： Succ→Mal；

14： Mal→OAA； 15： PEP+CO₂→OAA； 16： OAA→PEP+CO₂； 17： Pyr+CO2→OAA；

18： Glc6P→Ribu5P+CO₂； 19： Ribu5P→Rib5P； 20： Xyl5P→Ribu5P；

21： Ribu5P→Xyl5P； 22： Xyl5P+Rib5P→GAP+Sed7P； 23： GAP+Sed7P→E4P+Fru6P；

24： Xyl5P+E4P→Fru6P+GAP； 25： Fru6P+GAP→Xyl5P+E4P； 26： Pyr→Acet；

27： Acet→AcCoA； 28： αKG→Glu； 29： OAA+Glu→Asp； 30： Asp→Thr；

31： Thr→α-KB； 32： α-KB→KMV； 33：KMV+Glu→Ile+αKG。

2.2　L-异亮氨酸溶氧控制

从生化反应网络中可以看出，葡萄糖主要经三条途径代谢： EMP、HMP和TCA途径。据文献可知，TCA途径代谢流明显随转速增大而增大。从异亮氨酸的代谢流角度来看，发酵中后期维持转速在500转/分对异亮氨酸的生成比较有利。而600转/分的转速显然供氧过度，导致碳架在TCA途径消耗过多。

图2　由葡萄糖到L-异亮氨酸的最优途径和通量分布

从副产物氨基酸的代谢流来看，低转速时产杂酸较多，差不多每一种副产氨基酸的代谢流均要比高转速时要大，尤其是副产缬氨酸明显过多。这说明供氧充足有利于抑制杂酸。但是供氧过度又会造成TCA途径流量过大，导致异亮氨酸的代谢流减小。副产物苏氨酸的积累量在上述三种供氧条件下几乎没有变化。苏氨酸是异亮氨酸的直接前体物，如果TD酶反馈抑制彻底解除，则不会有Thr的积累，而实验结果说明TD酶并未完全解除反馈调节，所以需要从遗传角度进一步加以改造。

在发酵过程中，发酵延迟期和对数生长期细胞需要TCA循环提供大量能量，在产酸期则可以适当减少TCA循环的流量。

在其他发酵条件相同的情况下，控制不同转速进行5L罐的分批发酵。求解得到发酵过程不同时刻生长速率与产酸速率随时间的变化曲线结果，如图3所示。

图3　不同转速对生长速率和产酸速率的影响

通过图3可以发现，在不同的转速水平下，菌体的增长速率和产酸速率都有一个最大值，并且它们达到最大值的时间不相同，分析生长动力学曲线发现，当转速为600r/min时，菌体生长存在着最大生长增长速率；根据在不同转速下L-异亮氨酸形成速率随时间的变化关系曲线可以看出，当转速为500r/min时，菌体的产酸率存在着最大的产酸增长率。结合溶氧（即转速）对菌体细胞生长以及代谢的影响来看，溶氧过低不但对菌体的生长不利，而且此时产物形成速率也最小，所以影响发酵产酸。由图3可知，产物形成的最适转速值和菌体生长最适转速值是不同的，因此在以往发酵中对于转速恒定的操作，不能同时保证菌体生长和产物形成处于最适的环境中。由此分析结果得到菌体保证菌体生长和产酸最适的转速控制时期，如表1所示。

表1　发酵中最大生长速率和产酸速率在不同转速下的时期

在发酵中生产的目的就是使基质的消耗尽可能多地转化为产物。由于产物的形成速度和菌体浓度有关，因此发酵中必须控制转速，使菌体在较佳的溶氧环境中得到生长，但是同时保证溶氧使菌体在较佳的环境中最大限度地合成目的产物，一般来讲相同的转速不能够同时满足两者的最佳值的，这就必须对发酵过程的转速进行分阶段控制。结合表2-1所得到的转速控制模型，如表2所示。

表2　发酵过程中转速控制方式

为了验证分阶段供氧控制模式下L-异亮氨酸发酵情况，在其他条件相同的情况下，对比溶氧恒定和溶氧分阶段控制两种方式对L-异亮氨酸发酵产酸的影响，结果如表3所示。

表3　不同供氧控制模式对L-异亮氨酸发酵的影响

注： （1）溶氧恒定（转速500r/min） ； （2）溶氧分阶段控制（按照以上分阶段控制模式）

由表3可知，通过控制方式（2）发酵生产L-异亮氨酸比控制方式（1）发酵产酸提高了15.77%，说明分阶段供氧发酵促进目的产物L-异亮氨酸发酵的生成。

附录：化学计量平衡式

r1： GLUC+ATP=GLUC6P+ADP+H

r2： GLC6P=Fru6P

r3： Fru6P+ATP=2GAP+ADP

r4： GAP+ADP+NAD=PEP+ATP+NADH+H₂O

r5： PEP+ADP=ATP+PYR

r6： Pyr+CoA+NAD=AcCoA+CO₂+NADH

r7： GLC6P+H₂O+2NADP=RIBU5P+CO₂+2NADPH

r8： RIBU5P=XYL5P

r9： RIBU5P=RIB5P

r10： XYL5P+RIB5P=SED7P+GAP

r11： XYL5P+E4P=FRU6P+GAP

r12： GAP+SED7P=FRU6P+E4P

r13： AcCoA+OAA+H₂O+NADP=αKG+CoA+CO₂+NADPH

r14： αKG+CoA+NAD=SUCCOA+CO₂+NADH

r15： NH3+αKG+NADPH=GLUT+H₂O+NADP

r16： SUCCOA+ADP=SUC+CoA+ATP

r17： SUC+H₂O+FAD+NAD=OAA+FADH+NADH

r18： PEP+CO₂+GDP=OAA+GTP

r19： OAA+GLUT+ATP+NADPH=αKG+ADP+NADP+ASA

r20:ASA+PYR+NADPH+SUCCOA+GLUT+2H₂O+H=LYS+NADP+SUC+CoA+αKG+CO₂

r21： ASA+NADPH+ATP+H²O=THR+NADP+ADP+Pi

r22： THR+HE-TPP+NADPH+GLUT=ILE+NH4++NADP+H²O+αKG

r23： THR

r24： PYR+GLUT=ALA+αKG

r25： PYR=HE-TPP+CO₂

r26： HE-TPP+PYR+NADPH=αKIV+NADP+H₂O

r27： αKIV+GLU=VAL+αKG

r28： AcCoA+αKIV+H₂O+NAD+GLU=CO₂+CoA+NADH+αKG+LEU

参考文献：

[1]张蓓.代谢工程[M].天津:天津大学出版社，2003

[2]魏春，陈宁.代谢网络定量分析研究进展[J].生物技术通讯，2002. （3）

[3]王健，张蓓，张克旭，杨海军，陈宁.色氨酸产生菌TQ2223的途径分析.无锡轻工业大学学报.2003，22（5）:15～18

[4] Schilling CH，Letscher D and Palsson BO.Theory for the systemic defination of metabolic pathways and their use in interpreting metabolic function from a pathway-oriented perspecteve [J]. J Theor Biol，2000，203（2） :229～248

[5] Schilling CH，Palsson BO. Assessment of the metabolic capabilities of H.influenzae Rd through a genomic scale pathway analysis[J]. J Theor Biol，2000，203:249～283

[6] Schuster，R and Sehuster，S. Refined algorithm and computer program for calculating all nonnegative fluxes admissible in steady states of biochemical reaction systems with or without some flux rates fixed. Comp. Appl. Biosci，1993，9:79～85

[7]张蓓，张克旭，王健，等.基于途径分析的鸟苷发酵条件优化.云南大学学报（自然科学版） ，2004，26（6A） :74～78

[8]刘勇，陈雅丽，张长铠，李昆峰. L-异亮氨酸发酵对氧需求的研究.生物技术，1998，8 （1） :26～28

[9]陈宁，常高峰，等. L-异亮氨酸发酵培养基的响应面法优化.食品与发酵工业，2004，30 （2） :33～37

[10]张伟国，陈坚，伦世仪.供氧对L-异亮氨酸分批发酵的影响.无锡轻工大学学报，2001，（5）