酶法合成-半胱氨酸的产酶条件研究

酶法合成L-半胱氨酸的产酶条件研究

寇广会¹　周昌平¹　徐庆阳¹　刘淑云¹　陈宁^1，2

（1.天津科技大学生物工程学院； 2.天津市工业微生物重点实验室　天津　300222）

摘要：以假单胞菌（Pseudomonas sp.） TS1138为供试菌株，对酶法合成L-半胱氨酸的产酶条件进行了初步研究。通过对产酶培养基中的碳氮源进行研究，得出了TS1138菌株产酶的最佳碳氮源分别为葡萄糖和尿素，DL-ATC的最适添加量为5g/L；通过对产酶条件进行研究，得出了产酶培养基的最适初始pH为8.0，500ml三角瓶的最适装液量为40ml。

关键词：假单胞菌；酶法合成； L-半胱氨酸

L-半胱氨酸是一种具有生理功能的氨基酸，是组成蛋白质的20多种氨基酸中唯一具有还原性基团巯基（-SH）的氨基酸^[1]，目前已在医药、食品添加剂和化妆品中广泛应用。在医药方面，半胱氨酸及其衍生物可用于肝脏药和解毒药、解热镇痛药、溃疡治疗药、疲劳恢复剂、输液及综合氨基酸制剂，特别是祛痰药。在食品方面，半胱氨酸可用作面包发酵助剂（催熟剂） 、奶粉及果汁用抗氧化剂的稳定剂及宠畜食物的营养剂等。在化妆品方面主要用于烫发精、防晒霜、养发精、生发水。目前，L-半胱氨酸的生产主要依靠人或动物的毛发经酸水解或碱水解后制取，但该方法收率低，水解过程产生大量刺激性气体，废酸处理困难^[2]。另外，由于卫生问题，从毛发提取的产品不符合医药的使用标准。有鉴于此，利用微生物法生产胱氨酸和半胱氨酸已成为人们研究和关注的方向^[3]。一些细菌特别是假单胞菌^[4，5，6]，有不对称水解DL-2-氨基-Δ2-噻唑啉-4-羧酸（DL-2-amino-Δ2-thiazoline-4-carboxylic acid，DL-ATC）合成L-半胱氨酸的能力。日本已报道了用DL-ATC为原料，采用微生物酶法合成L-半胱氨酸较为成熟的生产工艺。我国已有生产DL-ATC的厂家，但有关微生物转化DL-ATC生产L-半胱氨酸的报道较少。因此，微生物酶法转化DL-ATC合成L-半胱氨酸的研究具有重要意义。

1　材料与方法

1.1　菌种

假单胞菌（Pseudomonas sp.） TS1138，由南开大学生命科学学院微生物研究室提供。

1.2　培养基

1.2.1　完全培养基（g/L）

见参考文献^[7]。

1.2.2　种子培养基（g/L）

葡萄糖30，DL-ATC · 3H₂O 3，酵母粉10，蛋白胨10，尿素3，MnSO₄· 5H₂O 1，FeSO₄·7H₂O 0.01，MgSO₄· 7H₂O 0.5，NaCl 1.5，K₂HPO₄3，pH 7.5，0.1MPa灭菌15min

1.2.3　产酶培养基（g/L）

葡萄糖30，DL-ATC · 3H₂O 3，玉米浆3，尿素3，MnSO₄· 5H₂O 1，FeSO₄· 7H₂O 0.01，MgSO₄· 7H₂O 0.5，NaCl 3，K₂HPO₄3，pH 7.5，0.1MPa灭菌15min

1.3　培养方法

1.3.1　活化培养

接一环生长良好的斜面菌苔至装有30ml完全培养基的500ml摇瓶中，于旋转式摇床190r/min，29℃振荡培养12h。

1.3.2　种子培养

以10%接种量将上述活化培养液接入装有30ml种子培养基的500ml摇瓶中，于旋转式摇床190r/min，29℃振荡培养14h。

1.3.3　产酶培养

以10%接种量将种子培养物接入装有30ml产酶培养基的500ml摇瓶中，190r/min，29℃振荡培养22h。

1.4　分析方法

1.4.1　酶活力测定

（1）细胞悬液的制备：取一定培养液离心10min （4000r/min，4℃） ，弃去上清液，沉淀用pH 7.4的PBS缓冲液洗涤并重悬。继续离心10min，洗涤，重悬。第三次离心后，洗涤，重悬菌液。该菌悬液即为酶促反应所用细胞悬液。

（2）酶促反应：取3ml底物溶液（DL-ATC1.5%，K2HPO4 1.5%）于10ml离心管内，接着加入1.5ml细胞悬液，置于42℃水浴中，反应2h后取出离心管，测定L-半胱氨酸含量。

（3）酶活力定义：在上述条件下，1h内转化底物生成1μg产物L-半胱氨酸所需的酶量作为一个酶活力单位（U） 。酶活力以每毫升酶液所含的酶活力单位数表示（U/ml）^[8]。

1.4.2　L-半胱氨酸含量的测定

采用酸式茚三酮法测定^[9]。

2　结果与分析

2.1　不同碳源对产酶的影响

将产酶培养基中的葡萄糖碳源分别用蔗糖、乳糖、乙醇、甘油替代，经产酶培养后，考察不同碳源对细胞产酶的影响，结果如表1所示。

表1　不同碳源对产酶的影响

表1结果表明，除葡萄糖和甘油对产酶有促进作用以外，其他3种碳源只能使细胞微弱地产酶。由此可以看出，在所考察的几种碳源中，葡萄糖是TS1138菌株产酶的最佳碳源。

2.2　不同氮源对产酶的影响

在产酶培养基中分别添加常用的3种有机氮源（牛肉膏、蛋白胨、酵母粉）和3种无机氮源（尿素、氯化铵、硫酸铵） ，同时以不添加上述氮源为对照，经产酶培养后，考察不同氮源对细胞产酶的影响，结果如表2所示。

表2　不同氮源对产酶的影响

由表2可以看出，尿素和硫酸铵对TS1138细胞产酶均有不同程度的促进作用，而其他4种氮源不利于细胞产酶。由此得出，在所考察的几种氮源中，尿素是该菌株产酶的最佳氮源。

2.3　产酶培养基初始pH对产酶的影响

培养基的初始pH对微生物产酶有一定的影响。实验考察了产酶培养基的不同初始pH对产酶的影响，结果如图1所示。

图1　产酶培养基初始pH对产酶的影响

由图1可知，产酶培养基的初始pH为8.0时对细胞产酶较为有利，因此确定产酶培养基的最适初始pH为8.0。

2.4　DL-ATC添加量对产酶的影响

由于TS1138菌株来源于富含DL-ATC的环境，能以DL-ATC作为唯一的碳氮源进行生长，因此实验考察了产酶培养基中DL-ATC不同添加量对产酶的影响，结果如图2所示。

图2　DL-ATC添加量对产酶的影响

由图2可以看出，随着DL-ATC添加量的增加，酶活力呈现显著的上升趋势，因此可以认为DL-ATC对TS1138菌株转化DL-ATC合成L-半胱氨酸的酶活力具有诱导作用，该酶系的酶属于诱导酶。但DL-ATC添加量超过0.7%时，酶活力有明显下降。

2.5　产酶培养基摇瓶装液量对产酶的影响

在摇瓶培养过程中，装液量的多少直接影响通风量的大小，通风量又与细胞的酶活力有很大关系。微生物对氧的需求都有一个临界浓度，供氧过少，会抑制微生物的正常生长；供氧过多则可能会改变微生物的代谢途径，不利于酶的合成。实验考察了500ml摇瓶中装液量分别为30ml、40ml、50ml、60ml、80ml时，对产酶的影响，其结果如图3所示。

图3　不同摇瓶装液量对产酶的影响

由图3可知，500ml三角瓶中产酶培养基的最适装液量为40ml，装液量过高或过低均不利于细胞产酶。

3　结论

本研究对产酶培养基中的碳氮源进行了对比实验，得到了TS1138菌株产酶的最佳碳氮源分别为葡萄糖和尿素；通过考察产酶培养基的初始pH对产酶的影响，得出产酶培养基的最适初始pH为8.0；通过对产酶培养基中DL-ATC添加量的研究，得到了DL-ATC的最适添加量为5g/L，同时得出DL-ATC对TS1138菌株转化DL-ATC合成L-半胱氨酸的酶活力具有诱导作用，该酶系的酶属于诱导酶；通过对摇瓶装液量的研究，得出500ml三角瓶的最适装液量为40ml，同时发现摇瓶装液量的多少与细胞的酶活力有很大关系。

参考文献：

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[8]刘忠，杨文博，孙丹.酶法生产L-半胱氨酸培养基的响应面分析优化[J].南开大学学报（自然科学版） ，2004，37 （1）:83～87

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