红谷霉素补料分批发酵工艺的研究

红谷霉素补料分批发酵工艺的研究⁽¹⁾

熊智强　徐　平　黄　林　涂国全

（江西农业大学生物工程系　南昌　330045）

摘要：以链霉菌702 D42-34为供试菌株，对链霉菌702产红谷霉素15L罐补料分批发酵进行研究。通过补料时间、补料成分、补料方式对红谷霉素发酵的影响，确定了红谷霉素补料分批发酵的较优工艺条件为：发酵到48h，补黄豆饼粉2.5g/L。在此工艺下，最终红谷霉素产量为2047.5μg/ml，对葡萄糖的转化率达到0.2%，发酵罐生产力达到0.0213 g/L · h，比分批发酵的生产力提高了57.8%，实验结果表明红谷霉素补料分批发酵明显优于分批发酵。

关键词：链霉菌702；红谷霉素；补料；发酵；工艺

江西农业大学生物工程系应用微生物研究室从土壤中分离筛选到一株链霉菌，简称链霉菌702，其所产生物活性物质对棉花枯萎病菌有较强的抑菌活性，进一步测定它的抗菌谱，发现其所产生生物活性物质抑制革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌，同时还能抑制霉菌和酵母菌^[1]。稳定性的研究测定表明其对热和紫外线稳定，在pH3-pH12条件下稳定，从该菌的发酵产物分离提取和纯化其抗细菌活性物质，经紫外、质谱和核磁共振谱等测定结果表明，该活性物质为与国外报道的放线菌素X2^[2]为同质，命名为红谷霉素。

分批发酵有操作简单，周期短，染菌的机会减少和生产过程，产品质量易掌握等优点，但对基质浓度敏感的代谢产物，如抗生素等，用分批发酵不合适，因其代谢产物合成周期较短，产率较低。这主要是由于养分的耗竭，无法维持下去。采用补料分批发酵是在分批发酵过程中补入新鲜的料液，以克服由于养分的不足，导致发酵过早结束。为了更好的控制红谷霉素的发酵过程和提高红谷霉素在发酵罐中的产量，本文对红谷霉素15L罐补料分批发酵进行研究，以期为最佳发酵工艺条件控制提供理论基础，从而使生产控制达到最优化^[3]。

（页下注）*通讯作者　　　E-mail： tuguoquan@263.net

1　材料与方法

1.1　材料

1.1.1　供试菌株

①链霉菌702 （Streptomyces 702） D42-34：由江西农业大学生物工程系应用微生物实验室分离筛选获得，甘油冻存管保存。②抑菌测定指示菌：金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus sp） ，由江西农业大学生物工程系应用微生物实验室保藏。

1.1.2　培养基

供试菌斜面、平板和茄子瓶培养基：高氏一号培养基；种子培养基：玉米淀粉10 g、玉米粉30 g、黄豆粉10 g、硫酸铵0.5 g、碳酸钙6 g，豆油2ml，定容至1L；发酵培养基：玉米淀粉20 g、玉米粉20 g、葡萄糖20 g、黄豆粉23g、硝酸钾2.5 g、蛋白胨9 g、硫酸铵2.5 g、磷酸二氢钾0.3 g、氯化钠3 g、碳酸钙5 g，豆油10ml，定容至1L；指示菌斜面、平板培养基：药典Ⅱ号培养基^[4]。

1.1.3　红谷霉素标准品（含量99.47%）

江西农业大学生物工程系提供。

1.2　方法

1.2.1　链霉菌702种子培养

取链霉菌702试管斜面制成孢子菌悬液，取适量体积接种于装有400ml种子培养基的2000ml三角瓶中，30℃，200r/min回转式摇床振荡培养36h。

1.2.2　红谷霉素15L罐发酵

取链霉菌702种子培养基以5%的接种量接种于装有10L发酵培养基的15L发酵罐中，发酵以转速200r/min，通气量15NL/min，30℃下培养96h。

1.2.3　分析方法

红谷霉素效价测定采用一剂量法^[4]；生物量的测定采用干重法^[5]；葡萄糖的测定采用邻甲基苯胺法^[6]。

2　结果与分析

2.1　红谷霉素15L罐分批发酵

采用方法1.2.2中所述条件进行红谷霉素15L罐分批发酵，检测发酵过程中葡萄糖浓度、生物量和红谷霉素产量工艺指标，实验结果图1所示。

从图1中可知，链霉菌702次级代谢中存在两个典型的生理阶段，即菌体生长阶段和代谢产物合成阶段。在菌体生长阶段，营养物质的消耗用来满足菌体发育、生长和繁殖的需要，发酵液中葡萄糖迅速下降，生物量迅速增加，并伴随着极少量的红谷霉素的产生。当发酵液的葡萄糖消耗到25%以下时，菌体生长速度减慢，原来被阻遏的次级代谢产物合成的酶系被激活而开始合成大量的红谷霉素，即由菌体生长阶段转变为次级代谢产物合成阶段。

图1　分批发酵过程曲线

2.2　补葡萄糖对红谷霉素发酵的影响

由于从红谷霉素分批发酵可知，发酵液中葡萄糖在36小时后消耗了75%左右，因此选择从36小时开始在不同时间补加不同量的葡萄糖，96h后考察发酵液产素能力，每组试验的效价是三个重复的平均值，试验结果见表1。

表1　补葡萄糖对红谷霉素的影响

从表1中可以看出，一次性补葡萄糖和多次间歇补葡萄糖对红谷霉素产量均无提高，反而抑制了红谷霉素的产量，说明补加葡萄糖对红谷霉素产量不利，这与Jones^[7]报道添加葡萄糖抑制放线菌素的合成相符合。特别是发酵60h时加葡萄糖3g/L，使红谷霉素效价仅达到726μg/ml，比对照（不补加葡萄糖）红谷霉素产量降低了45%。

2.2　补黄豆饼粉对红谷霉素发酵的影响

本实验研究从36小时开始在不同时间一次补加相同量的黄豆饼粉，96h后考察发酵液产素能力，每组试验的效价是三个重复的平均值，试验结果见表2。

表2　补黄豆饼粉对红谷霉素的影响

从表2可知，一次性加黄豆饼粉有利于红谷霉素增产，发酵48h时加黄豆饼粉2.5g/L，可使红谷霉素效价达到2090μg/ml，比对照（不补加黄豆饼粉）红谷霉素产量提高了49%。黄豆饼粉能使红谷霉素增产可能是由于红谷霉素是一个由氨基酸组成的多肽，色氨酸、苏氨酸等是它的前体物质，而补加黄豆饼粉促使链霉菌702自身合成出更多的红谷霉素前体物质，从而使红谷霉素增产。

2.3　红谷霉素15L罐补料分批发酵

采用方法1.2.2中所述条件进行红谷霉素15L罐补料分批发酵，当发酵到48h后，向发酵罐中一次性补加黄豆饼粉25g，实验结果如图2所示。

图2　补料分批发酵过程曲线

2.4　不同发酵方式对红谷霉素发酵的影响

本实验研究在发酵条件相同的情况下，分别采用分批发酵与补料分批发酵两种方式进行发酵，实验结果见表3。

表3　不同发酵方式对红谷霉素的影响

由表3可知，从红谷霉素产量、葡萄糖转化率、菌体浓度和发酵罐生产力来看，补料分批发酵培养均明显优于分批培养，补料分批发酵的发酵罐生产力达到0.0213 g/L · h，是分批发酵的发酵罐生产力0.0135 g/L · h的1.578倍。

3　小结与讨论

3.1　通过补料时间、补料成分、补料方式对红谷霉素发酵的影响，确定了红谷霉素补料分批发酵的较优工艺条件为：发酵到48h，补黄豆饼粉2.5g/L。在此工艺下，在15L全自动发酵罐发酵，发酵时间为96h，最终红谷霉素产量为2047.5μg/ml，菌体浓度57.6g/L，对葡萄糖的转化率达到0.2%，发酵罐生产力达到0.0213 g/L · h，而分批发酵的红谷霉素产量为1292μg/ml，菌体浓度45.6g/L，对葡萄糖的转化率达到0.13%，发酵罐生产力达到0.0135 g/L · h。

3.2　从红谷霉素产量、菌体浓度、葡萄糖转化率和发酵罐生产力来看，补料分批发酵培养均明显优于分批培养，发酵罐生产力达到0.0213 g/L · h，比分批发酵的罐生产力提高了57.8%。

从实验结果来分析，如果要提高葡萄糖的转化率和发酵罐的生产力，必须增加红谷霉素合成酶系对底物的竞争能力，使黄豆饼粉尽可能的用作红谷霉素合成底物，提高用于产红谷霉素的底物的量。另外一些副产物的形成与发酵条件有关，通过进一步改善和优化供氧、pH、温度等发酵条件下，可以降低副产物的积累，从而进一步提高转化率和生产力。

参考文献：

[1]李昆太，黎循航，涂国全.702生物防腐剂对细菌霉菌和酵母菌类抑菌效果的初步测定[J].江西农业大学学报（自然） ，2002，24 （5） :599～602

[2] Masafumi Shimizu，Yasuhiro Igarashi，Tamotsu Furumai，et al. Identification of endophytic Streptomyces sp. R-5 and analysis of its antimicrobial metabolites[J]. J Gen Plant Pathol，2004，70:66～68

[3]陈坚，堵国成，李寅，等编著.发酵工程实验技术[M].北京:化学工业出版社，2003.199～202

[4]国家药典委员会编.中华人发共和国药典（二部） [S].北京:化学工业出版社，2005.附录80

[5]陈坚，堵国成，李寅，等.发酵工程实验技术[M].北京:化学工业出版社，2003.139～143

[6]陈均辉，陶力，李俊，等著.生物化学实验（第三版）[M].北京:科学出版社，2003.11～13

[7] Jones，G. H. Combined purification of actinomycin synthetaseⅠand 3 -hydroxyanthranilic acid 4 -methyltransferase from Streptomyces antibioticus[J]. J. Biol. Chem,1993，268:6831～6834

【注释】

(1)基金项目：国家教育部重点项目（No.2003-03072） ;江西省自然科学基金（No.050010）