红谷霉素生料发酵工艺的研究

红谷霉素生料发酵工艺的研究⁽¹⁾

熊智强　徐　平　黄　林　涂国全⁽²⁾

（江西农业大学生物工程系　南昌　330045）

摘要：在摇瓶条件下，对链霉菌702生料发酵生产红谷霉素进行研究。采用单因素实验优化生料发酵工艺，筛选出生料发酵条件为每升发酵培养基中添加红谷霉素0.05625g，链霉菌702所产抗真菌活性物质0.045g和7.5%种子接种量。在此条件下进行生料发酵，使红谷霉素摇瓶发酵单位为1460μg/ml，超到常规灭菌发酵水平，实验结果表明红谷霉素生料发酵是一种潜在可行的发酵方法，不但可以很好的节约发酵成本，还可以提高发酵产量。

关键词：链霉菌702；红谷霉素；生料发酵

20世纪70年代中东战争爆发引起世界性的能源危机，各行各业为了避免今后再受到能源的影响，而积极寻求各种途径，生料发酵课题便在此背景下应运而生，各国专家学者争相研究这一课题，并且在酿酒、酿醋、单细胞蛋白生产中获得成功^[1]。就酿酒行业而言，与传统的酿造技术相比，生料酿酒可节约能源50%，降低生产成本37%，降低劳动强度30%左右，可改善劳动条件（特别是夏季高温季节） ，不会出现夏季掉排减产，其酒质带有蜂蜜味，风味独特，市场前景看好^[2～5]。但生料发酵目前仅限于这几个行业，医药行业尚未能采用这项技术，其主要原因是发酵过程中不能很好的解决染菌问题和目前这方面的研究及报道较少。

江西农业大学生物工程系应用微生物研究室从土壤中分离筛选到一株链霉菌，简称链霉菌702，其所产生物活性物质对棉花枯萎病菌有较强的抑菌活性，进一步测定它的抗菌谱，发现其所产生生物活性物质抑制革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌，同时还能抑制霉菌和酵母菌^[6]。稳定性的研究测定表明其对热和紫外线稳定，在pH3～12条件下稳定，从该菌的发酵产物分离提取和纯化其抗细菌活性物质，经紫外、质谱和核磁共振谱等测定结果表明，该活性物质为与国外报道的放线菌素X2^[7]为同质，命名为红谷霉素。抗真菌活性物质单体化合物也已获得，完成其紫外、红外、质谱测定，分子量为886，属大环内酯化合物，分子结构待其核磁共振和X衍射结果才能确定。

由于链霉菌702所产生物活性物质在极其微量的浓度下能杀灭培养液中革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌、酵母菌和霉菌，而对链霉菌702自身的生长和产素并无影响，因此本文对链霉菌702生料发酵红谷霉素工艺进行了初步研究，探索了红谷霉素摇瓶生料发酵的可能性和可行性，为红谷霉素罐上生料发酵提供试验依据，其结果可望对实际生产有所帮助。

1　材料与方法

1.1　材料

1.1.1　供试菌株

链霉菌702 （Streptomyces 702） D42-34：由江西农业大学生物工程系应用微生物实验室分离筛选获得，甘油冻存管保存。

抑菌测定指示菌：金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus sp） ，由江西农业大学生物工程系应用微生物实验室保藏。

1.1.2培养基

供试菌斜面、平板和茄子瓶培养基：高氏一号培养基；种子培养基：玉米淀粉10 g、玉米粉30 g、黄豆粉10 g、硫酸铵0.5 g、碳酸钙6 g，豆油2ml，定容至1L；发酵培养基：玉米淀粉20 g、玉米粉20 g、葡萄糖20 g、黄豆粉23g、硝酸钾2.5 g、蛋白胨9 g、硫酸铵2.5 g、磷酸二氢钾0.3 g、氯化钠3 g、碳酸钙5 g，豆油10ml，定容至1L；指示菌斜面、平板培养基：药典Ⅱ号培养基^[8]。

1.1.3　红谷霉素标准品

江西农业大学生物工程系提供。

1.2　方法

1.2.1　链霉菌702种子培养

取链霉菌702试管斜面制成链霉菌702孢子菌悬液，取10⁸个链霉菌702孢子接种于装有400ml种子培养基的2000ml三角瓶中，30℃，200r/min回转式摇床振荡培养36h。

1.2.2　链霉菌702生料摇瓶发酵培养

方法一：取链霉菌702种子培养基以5%的接种量接种于装有40ml不灭菌的发酵培养基的250ml三角瓶中，30℃，200rpm回转式摇床振荡培养96h。方法二：取10⁸个链霉菌702孢子接种于装有40ml不灭菌的发酵培养基的250ml三角瓶中，30℃，200rpm回转式摇床振荡培养144h。

1.2.3　链霉菌702摇瓶常规灭菌发酵培养

取链霉菌702种子培养基以5%的接种量接种于装有40ml灭菌的发酵培养基的250ml三角瓶中，30℃，200rpm回转式摇床振荡培养96h。

1.2.4　链霉菌702菌丝体无水乙醇浸提液（简称为702浸提液）和链霉菌702发酵液（简称为702发酵液）的制备

取高浓度的702浸提液和702发酵液，配制成每ml含红谷霉素1500μg，含链霉菌702所产抗真菌活性物质1200μg的低浓度的702浸提液和702发酵液。

1.2.5　分析方法

红谷霉素效价测定采用一剂量法^[8]；链霉菌702抗真菌活性物质效价测定采用文献中所述的测定方法^[9]；实验结果统计分析采用SASVersion 6.12软件对实验数据进行分析^[10]。

2　结果与分析

2.1　生料发酵条件的选择

本实验每个250ml三角瓶除加入40ml不灭菌的发酵培养基外，另外添加不同量的702浸提液或702发酵液，接种方式为按方法1.2.2中所述直接加入链霉菌702孢子或链霉菌702种子，最后考察生料发酵的产红谷霉素能力。实验安排及结果见表1。

表1　生料发酵条件对红谷霉素的影响

从实验结果可知，在接种方式上，接培养了36h的链霉菌702种子明显比接链霉菌702孢子更有利于红谷霉素生料发酵，而且染菌机率明显更低。在添加方式上，加702菌丝体浸提液明显比不加或加702发酵液更有利于红谷霉素生料发酵，而且染菌机率明显更低。所以在接种方式上选择培养了36h的702种子，在添加方式上，选择加702浸提液。

2.2　浸提液添加量的确定

本实验研究0ml、0.5ml、1ml、1.5ml、2ml浸提液对摇瓶生料发酵的影响，将培养了36h的链霉菌702种子以5%的接种量接入发酵培养基进行摇瓶生料发酵，最后考察发酵液产素能力。实验结果如图1所示。由图可知，选取1.5ml浸提液/40ml发酵培养基为最佳浸提液添加量，即每升发酵培养基中添加红谷霉素0.05625g和链霉菌702所产抗真菌活性物质0.045g。

图1　不同浸提液添加量对摇瓶生料发酵的影响

2.3　不同接种量对生料发酵的影响

本实验研究2.5%、5%、7.5%、10%、12.5%不同接种浓度对生料发酵的影响，将培养36h的种子以不同的接种量接入不灭菌的发酵培养基的同时，再向每升发酵培养基中添加红谷霉素0.05625g和链霉菌702所产抗真菌活性物质0.045g进行摇瓶发酵，最后考察发酵液产素能力。实验结果如图2所示。由图2可知，选取7.5%种子接种量为最适接种量。

图2　不同种子接种量对摇瓶生料发酵的影响

2.4　生料发酵与常规灭菌发酵的比较

将链霉菌702分别进行生料发酵和常规灭菌发酵，测定其红谷霉素效价，结果见表2。

表2　生料发酵与常规灭菌发酵的比较

从表中可知，除去向生料发酵培养基中所添加的红谷霉素56.25μg/ml，生料发酵比常规灭菌发酵产红谷霉素还是更高，用配对比较t检验检验两种发酵方法对产红谷霉素是否存在差别，采用SAS Version 6.12软件进行分析，结果表明，两者在统计学上有极显著性差异。

3　小结与讨论

3.1　通过对链霉菌702生料发酵可行性研究，筛选出能进行生料发酵的发酵条件为：接链霉菌702种子，加链霉菌702发酵液的菌丝体浸提液。通过对生料发酵的优化，确定了每升发酵培养基中添加红谷霉素0.05625g，链霉菌702所产抗真菌活性物质0.045g和7.5%种子接种量

3.2　与常规灭菌发酵比较，通过优化的生料发酵条件进行链霉菌702发酵红谷霉素的产量由常规发酵的1161.6μg/ml提高到1460μg/ml，除去向生料发酵培养基中所添加的红谷霉素56.25μg/ml，产量提高了20.8%。实验表明在同等条件下，生料发酵链霉菌702产红谷霉素能力明显高于常规发酵，这有可能是由于在生料发酵中链霉菌702菌丝体与外界环境中的微生物共同竞争培养基中的养分，促使链霉菌702菌丝体分泌更多的抗菌活性物质，来拮抗外界环境中的微生物。

3.3　在链霉菌702发酵研究中，由于链霉菌702所产生物活性物质在极其微量的浓度下能杀灭培养液中革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌、酵母菌和霉菌，而对链霉菌702自身的生长和产素并无影响，因此首次尝试生料发酵对链霉菌702产红谷霉素的影响，探索了红谷霉素摇瓶生料发酵的可能性和可行性，试验表明采用生料发酵是一种潜在可行的发酵方法，与常规灭菌发酵相比，不但可以很好的节约发酵成本，还可以提高发酵产量，并为红谷霉素罐上生料发酵提供有益的试验依据，其结果可望对红谷霉素实际生产、甚至抗生素生产有所帮助和启迪。但此研究仅限于摇瓶发酵，应用到上罐发酵还可能会面临着如生料发酵罐上工艺调控、链霉菌702抗噬菌体问题、外部环境微生物对链霉菌702所产活性物质可能产生的耐药性或抗药性问题等大量的已知和未知的问题，仍需进一步进行深入的探索和研究。

参考文献：

[1]宫英振，李凤翔，郭卫芸，等.生料发酵技术的应用研究进展[J].酿酒，2005，32 （1） :22～24

[2]刘义刚.再论生料酿酒技术[J].酿酒科技，2000，（2） :45～47

[3]刘义刚.生料糖化与酿酒研究概述[J].酿酒科技，2000，（5） :40～43

[4]刘德海，杨玉华，李新杰.生料酒工艺研究[J].中国酿造，2001，（2） :27～28

[5]王怀能，王辉.生淀粉糖化的研究[J].酿酒科技，2000，（3） :32～34

[6]李昆太，黎循航，涂国全.702生物防腐剂对细菌霉菌和酵母菌类抑菌效果的初步测定[J].江西农业大学学报（自然） ，2002，24 （5） :599～602

[7] Masafumi Shimizu，Yasuhiro Igarashi，Tamotsu Furumai，et al. Identification of endophytic Streptomyces sp. R-5 and analysis of its antimicrobial metabolites[J]. J Gen Plant Pathol.2004，70:66～68

[8]国家药典委员会编.中华人发共和国药典（二部） [S].北京:化学工业出版社，2005

[9]熊智强，徐平，涂国全.链霉菌702产抗真菌生物活性物质发酵培养基的研究[A].杜连祥，张克旭，路福平主编.工业微生物研究进展-2005年中国工业微生物学术会议论文集[C].北京:中国轻工业出版社，2005

[10]金丕焕，苏炳华，贺佳.医用SAS统计分析[M].上海：复旦大学出版社，2000

【注释】

(1)基金项目：国家教育部重点项目（No.2003-03072） ;江西省自然科学基金（No.050010）

(2)通讯作者E-mail： tuguoquan@263.net