基于模糊理论的褐黄孢链霉菌发酵合成纳他霉素的动力学研究

基于模糊理论的褐黄孢链霉菌发酵合成纳他霉素的动力学研究

骆健美^1，2　金志华²　岑沛霖²　王敏¹

（1.天津市工业微生物重点实验室天津科技大学生物工程学院　天津　300222；

2.浙江大学化学工程和生物工程系　杭州　310027）

摘要：本文利用模糊理论将用自然语言描述的定性划分和用仪器设备测得的定量数据联系起来，建立完全符合人类思维习惯的、参数具有明确物理意义的定量生长动力学模型。并通过模型分析，确定合理划分细胞生长阶段的方法。最后以褐黄孢链霉菌发酵生产纳他霉素的过程为例，建立生长动力学模型，并对发酵过程中适应期、对数期和饱和期进行划分。结果表明，模糊动力学模型可以准确模拟纳他霉素中微生物的生长情况。模糊动力学模型中参数具有明确的物理意义，对数期隶属度函数对应于相对比生长速率曲线，而对数期的比生长速率对应整个发酵过程的最大比生长速率。因此，在数值微分法确定的相对比生长速率曲线基础上，可以确定合理的参数初值，从而只经过少数几次的参数调整，就可获得最终的模型参数，缩短了建模时间，为模型的在线自适应和在线应用提供了可能。褐黄孢链霉菌发酵生产纳他霉素的过程中对数期可以用菌体的相对比生长速率曲线来确定，在0.5的截集水平上，褐黄孢链霉菌发酵的对数期开始于5.2 h，结束于34.4 h。

关键词：模糊理论；褐黄孢链霉菌；纳他霉素；动力学模型

在间歇发酵和细胞培养过程中，细胞生长状况受到普遍关注^[1，2]。由于S型生长曲线最为常见，所以一般将发酵过程划分为适应期、对数期和饱和期三个阶段。在不同生长阶段，细胞的形态、能荷不同，核酸、蛋白质、糖类、脂类等大分子物质的分布都存在差异，最终这些差别体现到细胞分裂周期上，决定细胞生长的快慢。另外，不同阶段的细胞对外界刺激的响应不同，比如诱导子的最佳加入时期为对数生长后期^[3]，补加新鲜培养基的最佳时期在对数期和饱和期之间^[4]。因此，准确确定细胞所处的发酵阶段具有重要的理论和实际应用价值。

在实验研究和生产中，细胞阶段的划分是由有经验的发酵专家在参考生长曲线的基础上做出的。因此，这种定性划分必然受到专家经验的影响，具有主观性，导致不同人的划分并不一致。同时，实际应用中这种定性划分并不能直接提供精确定量的生长动力学模型。

本文以褐黄孢链霉菌发酵生产纳他霉素的过程为例，利用模糊理论建立生长动力学模型，并对发酵过程中适应期、对数期和饱和期进行划分。

1　材料与方法

1.1　生产菌株

褐黄孢链霉菌SG9-16，本实验室保存。

1.2　发酵培养基

淀粉5.0%，葡萄糖2.0%，黄豆饼粉2.0%，酵母抽提物0.5%，酪蛋白胨0.8%，MgSO₄· 7H₂O0.1%，KH₂PO₄0.05%，NaCl 0.2%，CaCO₃0.3%，pH 7.0。

1.3　培养条件

实验采用Ko-Biotech公司的KF-5 L全自动发酵罐，溶解氧保持在40%，通气量3 L/min，罐压0.01 MPa，28℃培养，培养时间96 h。

1.4　菌体干重的测定

见文献5。

1.5　纳他霉素产量的测定

见文献6。

2　结果与讨论

2.1　模糊生长动力学模型

针对S型生长曲线，将发酵过程划分为适应期（A） 、对数期（E）和饱和期（S）三个阶段，分别用隶属度函数μA （t） 、μE （t） 、μS （t）来描述，如图1所示。

图1　发酵过程模糊划分示意图

用三条模糊规则来定义不同生长阶段中菌体的生长情况:

根据以上模糊规则，经模糊推理^[4]可计算任意时刻t的菌体比生长速度：

式（2）又可以表示为：

由于适应期和饱和期分别位于对数期的前后，不相邻，因此以假定适应期和饱和期的交集为空。同时为减少模型的复杂程度，规定对于任意发酵时刻都有：

根据以上约束条件，可以确定细胞生长3个阶段的隶属度函数。设发酵时刻为对对数期的隶属度为1。即μ_E （t_E） =1。则适应期和饱和期的隶属度函数为：

在以上设定条件下，式（3）可以简化为：

根据比生长速率的定义μ=1 dx，可以获得描述菌体生长的差分方程为：x

在上述模型中，只有对数期隶属度函数和不同阶段的细胞生长速率待定。由于对数期位于整个培养周期的中部，所以其隶属度函数曲线应为峰型曲线。常用的对数期隶属度函数有正态分布函数、组合正态分布函数和组合SIGMOID函数：

根据实验中获得的菌体生长曲线数据，在选定对数期隶属度函数类型后，就可采用非线性最小二乘法拟合模型参数，确定隶属度函数，从而建立发酵过程的模糊动力学模型。

2.2　发酵阶段的划分

由于适应期和饱和期的细胞分裂生长非常慢，所以可以假定u_A=u_B=0，式（7）可以进一步简化为：

由于0≤μ_S （t）≤1，所以时对应的比生长速率为最大比生长速率，即

所以，对数期的隶属度函数为：

因此，对数期的隶属度函数曲线就是归一化的菌体比生长速率曲线，可以通过发酵过程中菌体干重的检测数据并用数据微分的方法求得，从而确定对数期。由于数据微分方法对数据中的误差较敏感，因此，该方法获得的对数期隶属度函数一般误差较大，只能作为一个初步结果。消除误差的方法是首先对生长曲线进行曲线拟合，然后对拟合函数求导来确定对数期隶属度函数。

2.3　纳他霉素发酵的模糊动力学模型与分析

对纳他霉素发酵的菌体干重数据进行数值微分，绘制比生长速率曲线见图2。由图2可知，当发酵时间超过72 h时，菌体的比生长速率小于0。所以，选取0～72 h之内的实验数据进行模糊动力学研究。选择正态分布函数作为对数期的隶属度函数，根据式（9） 、（12） ，有

根据图2，结合式（15） ，确定t_E、r、μ_E的最佳初值为t_E=20，r=18，μ_E=0.6

联立式（8）和（15） ，可以求取在0～72 h之内所有时刻的菌体干重。利用最小二乘法调整t_E、r、μ_E的取值，经过12次参数调整后，菌体干重的计算和实测值基本达到一致（见图3） ，此时模型参数为： t_E=19.8，r=17.4，μ_E=0.61。

图3显示模糊生长模型对实验数据具有良好的拟合能力，可以真实反映发酵过程中菌体的生长情况。根据模型参数，可以确定对数期、适应期和饱和期的隶属度函数，如图4所示。

图2　纳他霉素发酵比生长速率曲线

图3　模糊生长型对发酵数据的拟合分析

在实际应用中常采用对数期的截集来对上述模糊对数期进行去模糊化:

对于纳他霉素发酵

所以在0.5的截集水平上纳他霉素发酵的前5.2 h为适应期，5.2～34.4 h为对数期，34.4 h以后为饱和期。

图4　纳他霉素发酵中细胞生长阶段的模糊划

3　小结

模糊动力学模型可以准确模拟纳他霉素中微生物的生长情况。模糊动力学模型中参数具有明确的物理意义，对数期隶属度函数对应于相对比生长速率曲线，而对数期的比生长速率对应整个发酵过程的最大比生长速率。因此，在数值微分法确定的相对比生长速率曲线基础上，可以确定合理的参数初值，从而只经过少数几次的参数调整，就可获得最终的模型参数，缩短了建模时间，为模型的在线自适应和在线应用提供了可能。

对数期可以用菌体的相对比生长速率曲线来确定。在0.5的截集水平上，纳他霉素发酵的对数期开始于5.2 h，结束于34.4 h。

参考文献：

[1] Vladimir G D，Jury D T，Andrei J C. Method for producing human leukocyte interferon alpha-2. USP: 4680260，1987

[2]李志勇，郭杞远，李琳.藻类对微量元素的生物富集及其应用.微生物通报，1997，（3） ，12～14

[3]苗志奇，未作君，元英进.水杨酸在紫杉醇生物合成中诱导作用的研究.生物工程学报，2000，16 （4） ：106～110

[4] Yuan Y J，Miao Z Q，Li S Y. The fuzzy neural network controller in yeast fed-batch fermentation. Chemical Engineering Ommunication，1999，174： 163～167

[5]骆健美，金志华，岑沛霖.培养条件对褐黄孢链霉菌发酵合成纳他霉素的影响.浙江大学学报工学版，2005，39 （2）:296～300

[6]骆健美，金志华，岑沛霖. RP-HPLC法测定发酵液中纳他霉素含量.中国抗生素杂志，2004，29 （11） ：653～656