不同培养条件对冬虫夏草液体种子细胞生长的影响

不同培养条件对冬虫夏草液体种子细胞生长的影响

殷海松　谭之磊　黄皓　贾士儒

（天津市工业微生物重点实验室天津科技大学生物工程学院　天津　300222）

摘要：在摇瓶液体培养条件下，本文通过单因素试验，研究了不同培养条件对冬虫夏草液体种子细胞生长的影响。实验结果表明，冬虫夏草液体种子细胞生长的最宜条件为：培养温度24℃，转速150 r／min，装液量30% （75ml／250 ml） ，初始pH 6.0。在此条件下，经摇瓶培养，获得最大菌体干重为11.218 g/L。

关键词：冬虫夏草；培养条件；温度；转速；装液量；初始pH

冬虫夏草（Cordyceps sinensis.）隶属于真菌界（Fungi） 、真菌门（Eumycota） 、子囊菌亚门（Ascomycotina） ，子囊菌纲（Ascomycetes） 、肉座菌目（Hyposcreales） 、麦角菌科（Clavicipitaceae） 、虫草属（Cordyceps spp） ，为冬虫夏草菌的子座及其寄生蝙蝠蛾科昆虫蝙蝠蛾的幼虫尸体的复合体。现世界上报道的已有380余种，国内已发现60多种，主要分布于吉林、河北、四川、云南、西藏、青海等省区^[1，2，3]。

冬虫夏草具有补虚损、益精气、保肺、益肾、止血化痰、滋补强壮等功效，在中国从古代就被广泛用作滋补食品或补药。腺苷、虫草酸和虫草素是冬虫夏草的主要活性物质^[3]。但由于过度采集，自然界中野生虫草越来越少，而且价格很高。冬虫夏草液体发酵培养，国内外均有很多研究报道，并有一系列药品和保健食品在市场上销售，而且经多年的临床使用，冬虫夏草人工菌丝制品的药理作用与天然冬虫夏草几乎一致^[4]，个别有益指标高于天然冬虫夏草，但其价格要远远低于天然虫草。因此通过深层发酵获得菌丝体和代谢产物是一种非常有前途的方法。

本文对冬虫夏草液体种子的培养条件进行了研究，探讨了不同培养条件对冬虫夏草细胞生长的影响。

1　材料和方法

1.1　菌株

冬虫夏草（Cordyceps sinensis.） ，天津市工业微生物重点实验室保藏。

1.2　培养基

斜面种子培养基： PDA培养基。

种子液体培养基（g/L） ：马铃薯200 g/L、葡萄糖20 g/L、蛋白胨10 g/L、KH₂PO₄3 g/L、MgSO₄.7H₂O1.5 g/L。

1.3　仪器与设备

YHG-Ⅱ回转式恒温调速摇瓶柜； LD5-10型低速离心机； DGG型电热鼓风干燥箱；PHSJ-4A型数字pH计。

1.4　测定方法

生物量测定：取20 ml摇瓶发酵液，4000 r/min离心20 min，弃上清液，菌体用去离子水洗、再离心，此步重复三次。收集菌体，在60℃恒温烘箱中烘干至恒重，在干燥器中冷却到常温，称量。

pH值的测定： pH计测定。

2　结果与讨论

2.1　装液量对冬虫夏草细胞生长的影响

在250 ml三角瓶中，分别以20% （50ml/250 ml） 、30% （75 ml/250 ml） 、40% （100 ml/250 ml）装液量，在26℃，150 r/min的条件下，培养4天，结果如图1：

图1　不同装液量对冬虫夏草细胞生长的影响

从图1中可知，当装液量分别为20%、30%、40%时，在培养到第4天时，获得的细胞干重分别为6.76 g/L、7.65 g/L、7.51 g/L。结果表明装液量为30%时获得最大细胞干重7.65 g/L，装液量为20%时获得的菌体量最少6.76 g/L，但装液量为40%时，菌体量与30%时相差不大，因此我们在转速对冬虫夏草细胞生长影响实验中，通过提高转速进一步考察了装液量为30%和40%时对冬虫夏草细胞生长影响。试验中我们观察到，当装液量为30%时菌体形态要好于装液量为40%时，而且随着装液量增加菌球直径变小，这可能是因为菌球的大小与培养液的DO有关，装液量越大，同一转速下DO就越小，因此相应的菌球临界直径就越小^[5]。所以在装液量30%、40%菌体量相差不大的情况下，采用30%装液量。

2.2　培养温度对冬虫夏草细胞生长的影响

在250 ml三角瓶中，以30% （75 ml/250 ml）装液量，在不同的培养温度20℃、22℃、24℃、26℃、28℃下，150 r/min，培养4天。

图2　不同培养温度对冬虫夏草细胞生长的影响

不同培养温度对冬虫夏草细胞生长的影响如图2所示，当培养温度分别20℃、22℃、24℃、26℃、28℃时，在培养4天后获得的菌体量分别为8.724、10.25、10.44、7.41和0.70 g／L。实验结果表明培养温度24℃时获得了最大的菌体干重（DW） 10.44 g／L，28℃时获得的菌体干重最小0.70 g／L。所以从图2可知，较低的培养温度有利于冬虫夏草细胞生长，所以选24℃为冬虫夏草培养温度。

2.3　初始pH值对冬虫夏草细胞生长的影响

在250 ml三角瓶中，以30% （75 ml/250 ml）装液量，在不同的培养液起始pH值4.0、5.0、pH自然（5.32） 、5.5、6.0、7.0下，24℃，150 r/min，培养4天。

图3　不同培养液初始pH值对冬虫夏草细胞生长的影响

不同培养液起始pH值对冬虫夏草细胞生长的影响如图3所示，当培养液起始pH值分别为4.0、5.0、pH自然（5.32） 、5.5、6.0、7.0时，在培养4天后获得的菌体量分别为6.40、9.13、9.46、9.65、10.15、7.83 g／L。实验结果表明起始pH值6.0时获得了最大的细胞干重10.15 g／L，pH值4.0获得的细胞干重最小6.40 g／L，这可能是因为低培养液起始pH值会抑制细胞生长。另外从图-3中可知较高的起始pH值有利于细胞生长^[2]，但培养液起始pH值7.0时细胞生长相对缓慢，获得细胞干重仅为7.83 g／L。所以选pH值6.0为培养液的初始pH值。

2.4　转速对冬虫夏草细胞生长的影响

在250 ml三角瓶中，以30% （75 ml/250 ml）装液量，初始pH值6.0，在不同转速100、150、200 r/min下，24℃，培养4天。

图4　不同转速对冬虫夏草细胞生长的影响

因为在不同装液量的试验中发现30%和40%装液量时获得的细胞干重比较相近，因此在分析不同转速对虫草菌细胞生长的影响时，分别分析了装液量30%和40%时转速对虫草菌细胞生长的影响。从图4中可知，在装液量为40%时，150 r/min和200 r/min时细胞干重比较接近，原因可能是转速从150 r/min提高到200 r/min时DO没有明显提高，另一个原因可能是转速越高，剪切力越大，不利于菌体的生长。在装液量为30%时，150 r/min时获得的菌体最大，100 r/min时获得的菌体最小，可能是因为100 r/min时培养液的DO比较低，不利于菌体生长。与150 r/min相比，200 r/min时剪切力比较大，所以获得的细胞干重低于150 r/min时获得的细胞干重。所以综上所述，采用150 r/min为最终的转速。

2.5　在最适培养条件下冬虫夏草细胞生长随时间变化的曲线

在250 ml三角瓶中，以30% （75ml／250 ml）装液量，初始pH值6.0，转速150 r/min，24℃培养。

在最适培养条件下冬虫夏草细胞生长随时间变化的曲线如图5a所示，从图中可知冬虫夏草在培养到120h时获得了最大细胞干重11.22 g/L。培养液的pH值随培养时间的变化曲线如图5b所示，从图中可知随着冬虫夏草细胞生长培养液的pH值一直在缓慢下降，在培养一段时间后pH值基本保持不变，实验的结果与Xian-BingMao等^[5]的研究结果比较一致。

图5　（a、b）在最适培养条件下冬虫夏草细胞生长（A）及培养液pH值随时间变化的曲线

3　结论

实验结果表明，培养条件对冬虫夏草液体种子细胞生长有比较明显的影响，最适于冬虫夏草液体种子细胞生长的培养条件为：培养温度24℃，转速150r/min，装液量30% （75ml／250ml） ，初始pH6.0。在此培养条件下，经摇瓶培养，获得最大菌体干重为11.22g/L。

参考文献：

［1］汪玲玲.冬虫夏草菌多糖发酵研究[D].硕士学位论文，华南农业大学，2003

［2］毛先兵.深层培养药用蕈菌蛹虫草生产虫草素的研究[D].博士学位论文，华东理工大学，2004

［3］康廷国.中药鉴定学［M］北京：中国中医药出版社，2003

［4］王国栋.冬虫夏草及人工虫草菌丝防治肿瘤的研究概况[J] .中国中医药信息杂志，1999，6 （6） :14～15

［5］Xian-Bing Mao and Jian-Jiang Zhong.Hyperproduction of Cordycepin by Two-Stage Dissolved Oxygen Control in Submerged Cultivation of Medicinal Mushroom Cordyceps militaris in Bioreactors [J]. Biotechnol. Prog，2004，20： 1408～1413