水翁悬浮细胞系的建立及其悬浮培养的生长特性

水翁悬浮细胞系的建立及其悬浮培养的生长特性

周英彪　王瑞　肖冬光

（天津市工业微生物重点实验室天津科技大学生物工程学院　天津　300222）

摘要：建立了水翁悬浮细胞系，并对其悬浮培养的生长特性做了初步探讨。以水翁新生芽尖作为外植体，接种于添加有不同浓度和配比的生长调节物质及各种附加物的MS固体培养基中，诱导培养产生初代愈伤组织；挑选Ⅰ和II型的愈伤组织进行继代培养改良，考察愈伤组织的生长状况和统计生长量来决定最佳继代培养基的配方和得到适合悬浮的愈伤组织；将以上得到的愈伤组织转接于最佳继代液体培养基中，于24+1℃，120r/min条件下振荡培养，筛选分散度好、较均匀、生长快、色浅透明的细胞作为种子传代，数次传代后得到性能良好的悬浮细胞系；以细胞生长量（鲜重）为指标，绘制了水翁悬浮细胞的生长曲线。研究表明： 2.0mg/L的2，4-D的诱导率最高（92%，初代愈伤组织为Ⅰ型） ，II型愈伤组织的最高诱导率为75%；最佳的继代培养基配方为MS + 0.5mg/L 2，4-D + 0.5mg/L 6-BA + 1.0mg/L IAA + 0.5mg/L IBA + 0.5mg/L NAA + 0.1mg/L KT + 700mg/L LH ，形成II型愈伤组织的生长量可达3.28g/瓶（鲜重） ；液体继代培养3代后，可得到性能良好的悬浮细胞系；水翁悬浮细胞的生长曲线表明，最佳接种期为培养后的16-18d。

关键词：水翁；悬浮细胞系；生长曲线；悬浮培养

桃金娘科植物水翁（又称水雍、水榕）的干燥花蕾，其药化成分主要为黄酮甙、酚类、氨基酸，具有清热解毒，治外感、恶寒、发热、头痛，食滞不化的功效，在民间使用非常广泛，也是“清热凉茶”中成药的主要原料^[1]。目前，关于水翁花的研究报道不多。

早期的研究有： 1987年，陆碧瑶等^[2]研究了水翁花蕾挥发性化学成分； 1987年，王其新^[3]对水翁花进行了生药鉴定； 1990年，张凤仙、陆仁荣^[4]对水翁花蕾不挥发性化学成分进行了研究。直到2002年，以水翁花为主要原料的中成药在抗击SARS中起了一定的作用，从而引发新一轮的研究； 2002年，Woo Anthony Y.H等^[5]研究证实，水翁花蕾水提取物含有强心成分，能通过抑制Na⁺/K⁺-ATPase的活性加强了心脏的收缩功能，同时降低了心脏的收缩频率；在抗氧化方面，2002年卢艳花等人^[6]的研究表明，水翁花蕾水提取物对微粒体和神经细胞氧化损伤有很强的保护作用，有可能用于治疗与氧化损伤有关的脑疾，并于2005年建立了水翁花蕾水提取物对神经细胞氧化损伤保护作用的量效关系^[7]；同年，本实验室的研究表明，水翁花蕾水提取物对整合有HCV亚复制子的Huh-7细胞的生长有显著的抑制作用，表明水翁花蕾水提取物含有抗HCV的药物成分； 2005年度的国家自然科学基金对中山大学朱孝峰教授的《水翁花蕾有效单体ON-Ⅲ及其亚胺衍生物抑制受体酪氨酸激酶活性与抗肿瘤作用研究》进行了立项资助，表明水翁花蕾中可能含有抗肿瘤的药物成分。

可见，水翁花蕾中含有多种有开发前景的药物成分，深入研究水翁（尤其是其花蕾）的生理植化和水翁花蕾中内含物的药效关系很有必要。但水翁主要生长在华南两广地区，为高大乔木，且花期短和花量少，使水翁花成为一种稀有资源，这必将制约水翁花的深入研究和广泛开发利用。植物细胞培养不失为解决上述问题的一个好办法，直到目前为止，未见有关于水翁细胞悬浮培养方面的报道。本研究建立了水翁悬浮培养细胞系，并对其悬浮培养的生长特性做了初步探讨，可为水翁细胞的后续研究和大规模悬浮培养奠定基础。

1　材料与方法

1.1　实验材料及愈伤组织的诱导

实验材料取自中科院华南植物园当年生水翁幼苗的芽尖（500个） ，清水洗净后，70%的酒精消毒5min，0.1% HgCl浸泡10min，无菌水洗涤5次，超净台中切成5～10mm³的小块，接种在诱导培养基（配方与编号见表1）上，每个编号诱导培养基平衡接种50小块，放置于SPX-250B-Z型生化培养箱（上海博迅实业有限公司医疗设备厂）中，24±1℃下暗培养诱导愈伤组织生成，并判定愈伤组织的类型，及统计分析各种诱导培养基的诱导率。其中诱导率= （同编号诱导培养基中愈伤组织生成数/50） *100%。

表1　以MS为基础的诱导培养基中生长调节物质及附加物的配方表（mg/L）

注：表中生长调节物质的配方设计经计算机并结合实际经验进行了优化

1.2　水翁愈伤组织的继代培养和最佳继代配方的筛选

挑选诱导率大于50%的Ⅰ和II型愈伤组织，编号；选取能诱导外植体生成Ⅰ和II型愈伤组织的诱导培养基作为筛选最佳继代培养基的出发培养基，其编号、配方不变（与表1同） ；将不同编号的愈伤组织转接于各种继代培养基上，且每种继代培养基上平衡接种三个同一编号的愈伤组织，24±1℃下暗培养，每25d继代一次，继代三次。观察愈伤组织的生长类型，并统计生长量，从而决定最佳继代培养基的配方。其中生长量=收获量-接种量（g／瓶） ；接种量=接种后瓶重-接种前瓶重（g／瓶） 。

1.3　水翁悬浮细胞系的建立

选取经继代培养改良后质地松散、生长良好的愈伤组织，转接于装有30ml液体培养基（1.2中确定的最佳继代培养基配方不加琼脂）的100ml三角瓶中，于24+1℃，120r/min条件下振荡暗培养，筛选分散度好、较均匀、生长快、色浅透明的细胞作为种子传代，数次传代后，得到性能良好的悬浮细胞系。

1.4　水翁细胞摇瓶悬浮培养生长特性的测定

在30ml初始pH为5.8的液体最佳继代培养基（1.2中确定）中，培养温度为24±1℃、转速为120r/min、10%接种量的条件下，摇瓶振荡暗培养，培养32d，每隔4天取样，测定其生长量（平衡三瓶） ，以培养时间为横坐标，悬浮细胞的生长量（鲜重）为纵坐标，绘制生长曲线，考察其生长特性。其中生长量=收获细胞鲜重-初始接种细胞鲜重（g／30ml） ；细胞鲜重的测定方法为：悬浮细胞经100目尼龙网真空抽滤后称重。

2　结果

2.1　愈伤组织的诱导

培养30天后，水翁愈伤组织的诱导结果如表2所示。在此，对愈伤组织进行如下分类：Ⅰ为质地坚硬、块状、颜色鲜黄的胚性愈伤组织，即通常所说的胚性愈伤组织；Ⅱ为质地疏松、易分散、不分泌黏液的颗粒状胚性愈伤组织；Ⅲ为柔软、水渍、形状不规则、颜色淡白的非胚性愈伤组织。试验结果表明，以1号培养基的诱导率最高，达92%，其愈伤组织类型为Ⅰ型，该诱导培养基的配方为： MS + 2.0mg/L2，4-D； 5、8、10、14、15、16号培养基可诱导Ⅱ型愈伤组织生成，其中以5号培养基诱导率最高，达76%。挑选出诱导率大于50%的Ⅰ和Ⅱ型愈伤组织，编号为A、B、C、D、E （如表2所示） ，作为继代培养改良的出发愈伤组织；选定能诱导外植体生成Ⅰ和Ⅱ型愈伤组织的1、2、5、8、10、14、15、16号培养基作为筛选最佳继代培养基的出发培养基。

2.2　继代培养和最佳继代配方的筛选

不同愈伤组织在不同继代培养基中继代培养3代后的组织类型和平均生物量如表3所示，其中Ⅰ、Ⅲ型愈伤组织因不适合作悬浮培养而没有统计其生长量。可以直观地发现，所有的愈伤组织在16号培养基中皆形成适合作悬浮培养的Ⅱ愈伤组织，且D号愈伤组织在16号培养基中的平均生长量最大，达3.28g/瓶（鲜重，每瓶含30ml固体培养基） ，因而确定16号培养基（MS + 0.5mg/L2，4-D + 0.5mg/L6-BA + 1.0mg/L IAA + 0.5mg/L IBA+ 0.5mg/LNAA + 0.1mg/LKT + 700mg/L LH）为最佳继代配方，D号愈伤组织的继代培养产物作为建立悬浮细胞系的出发愈伤组织。

表2　愈伤组织的诱导结果

注:-表示因无愈伤组织生成而无分型； A、B、C、D、E是对要进行继代培养改良的愈伤组织的编号；√表示该编号的培养基选作为继代培养基优化的出发培养基； /表示该愈伤组织或培养基不进行后续继代培养。

表3　不同愈伤组织在不同继代培养基中继代培养3代后的组织类型和平均生长量（g/瓶）

注:Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ表示继代培养生成愈伤组织的类型； —表示因该愈伤组织不适合作悬浮培养而没有统计生长量；数值表示三个平衡样本的平均生物量。

2.3　水翁悬浮细胞系的建立

经过三代液体摇瓶振荡暗培养，继代时过滤结块粘结的细胞，得到均一性好、生长性能优良的水翁悬浮细胞。细胞形态如图1所示。

图1　水翁细胞悬浮培养的形态

2.4　水翁细胞摇瓶悬浮培养生长特性的测定

从水翁细胞悬浮培养的生长曲线（图2）可以得到如下结论：在0～4d是延迟期，4～12d是对数生长期，12～20d是快速生长期，在20～25d是减慢生长期，25d可达到最大生长量。悬浮培养继代时的“种子”宜选择培养了16～18d的悬浮细胞，此时的细胞生长旺盛，状态好，细胞量大。

图2　水翁细胞悬浮培养的生长曲线

3　讨论

植物细胞悬浮培养发展到目前已经是一种成熟的技术，国内外皆有成功进行产业化的例子。目前我国已建立了三七、人参、西洋参、三尖杉、紫草、洋地黄、长春花、丹参、红豆杉、毛地黄、黄连及雷公藤等十几种药用植物的液体培养系统，经过对培养基和培养条件的优化已使有效成分达到或超过原植株^[8]，因而水翁细胞悬浮培养生产有效药物成分是可行的。目前，虽已建立水翁细胞的悬浮细胞系，但要达到产业化的水平还有很多工作要做。下一步的工作主要围绕如下几个方面进行：悬浮培养基和培养条件的优化、细胞内含物的药物成分分析、高产有效药物成分细胞株筛选、扩大培养、药物成分的分离纯化等。

参考文献：

[1]江苏新医学院.中药大辞典（上册）[M].上海：上海人民出版社，1997

[2]陆碧瑶，李毓敬，朱亮峰，等.水翁花蕾和叶的精油的化学成分研究[J].广西植物，1997，7 （2）:173～179

[3]王其新.水翁花的生药鉴定[J].中草药，1998，29 （9） :630～631

[4]张凤仙，刘梅芳，陆仁荣.水翁花蕾化学成分的研究[J].植物学报，1990，32 （6） :469～472

[5] Woo Anthony Y H，Waye Mary M Y，Kwan H S.et a1.Inhibition of ATPases by Cleistocalyx operculatus： A Possible Mechanism for the Cardiotonic Actions of the Herb.[J].Vascular Pharmacology，2002，38： 163

[6]卢艳花，杜长斌，吴子斌，等.水翁花对微粒体和神经细胞氧化损伤的保护作用[J].中国中药杂志，2003，28 （10）:964～966

[7]卢艳花，杜长斌，吴子斌，等.水翁花对神经细胞氧化损伤保护作用的量效值[J].中国临床康复，2005，9（41） :171～173

[8]李冬杰，魏景芳.药用植物细胞悬浮培养研究进展[J].河北林业科技，2003，4:22～23