对苯丙氨酸解氨酶工程菌的生长及产物表达的影响

pH对苯丙氨酸解氨酶工程菌的生长及产物表达的影响

崔建东　赵颖　李飞　贾士儒

（天津科技大学生物工程学院天津市工业微生物重点实验室　天津　300222）

摘要：为了提高苯丙氨酸解氨酶的产量和活力，本研究对可高效表达圆红冬孢酵母苯丙氨酸解氨酶基因的重组大肠杆菌JM105进行培养，对其发酵过程中pH对工程菌的生长以及产物形成的影响进行了研究。结果表明，控制发酵过程中发酵液的pH高于不控制pH的菌体量和产酶活力，当控制pH为7.5左右时，菌体量以及酶活力明显高于不控制pH，同时表明，在控制不同pH条件下，pH为7.5时的菌体量和酶活是最高的。控制pH时5L发酵罐分批发酵菌体量和酶活分别可以达到OD₆₀₀=20（DCW=11g/L） ，总酶活为820U/L，分别比不控制pH高出33%和32%，此时的pH可能是菌体生长以及产酶的最适pH。

关键词：苯丙氨酸解氨酶；工程菌；发酵； pH

苯丙氨酸解氨酶（Phenylalanine Ammonia lyase，PAL，EC4.3.1.5）大多存在于高等植物和部分微生物（丝状真菌，酵母及链霉菌）中^[1，2，3]，该酶的作用主要是将苯丙氨酸催化生成肉桂酸和氨，同时微生物也可以将苯丙氨酸作为唯一的碳源或氮源加以利用，特别是在红酵母属中的PAL分布最为广泛^[4，5，6]。 PAL具有广泛的商业应用价值，在医疗方面可被用于监控苯丙酮尿患者血浆中的苯丙氨酸含量，并可用于治疗苯丙酮尿患者^[7]，也可用于制备低苯丙氨酸食品。由于该酶具有将反式肉桂酸和氨催化合成L-苯丙氨酸的性质，而L-苯丙氨酸是合成阿斯巴甜（APM）的主要原料^[8]，因此，目前研究较多的是使用红酵母内的L-苯丙氨酸解氨酶（PAL）在适当条件下转化反式肉桂酸生成L-苯丙氨酸^[9，10]。但是以红酵母作为酶源存在许多缺点，如酶活力低、不稳定、不利于大规模工业化生产的问题。因此，采用基因工程菌作为苯丙氨酸解氨酶的酶源是解决这些问题的有效途径。

本文报道了重组大肠杆菌生产苯丙氨酸解氨酶的研究结果，重点探讨了pH对工程菌生长以及产酶活力的影响。

1　材料与方法

1.1　菌种

重组大肠杆菌JM105 （PBV1-PAL，携带PAL基因，Amp抗性），本实验室构建保存。

1.2　培养基

1.2.1　种子培养基（%）

蛋白胨1，酵母粉0.5，NaCl 1，葡萄糖0.1，氨苄青霉素0.05，pH 7.0

1.2.2　发酵培养基（%）

葡萄糖2%，KH₂PO₄1.33%，（NH₄）₂HPO₄0.4%，MgSO₄· 7H₂O 0.12%，柠檬酸0.17%，微量元素: EDTA 8.4mg/L，CoCl₂· 6H₂O 2.5mg/L，MnCl₂· 4H₂O 15mg/L，CuCl₂· 4H₂O 1.5mg/L，H₃BO₄3mg/L，Na₂MoO₄· 2 H₂O2.5mg/L，Zn （CH₃COO）₂· 2H₂O，pH 7.0。

1.2　培养方法

1.2.1　种子培养

将-80℃保存的菌种吸取1ml转入装有50ml种子培养基500ml三角瓶中，30℃，200rpm培养12h。

1.2.2　摇瓶培养

吸取1ml上述种子转入装有50ml种子培养基500ml三角瓶中，30℃，200rpm培养12h。以10%接种量转入装有100ml发酵培养基的500ml三角瓶中，30℃，200rpm培养24h。

1.2.3　发酵罐培养

以10%接种量将种子接入发酵培养基，30℃，初始转速350rpm，DO维持在30%，装液量3L （DF2000-5L） 。在整个发酵过程中分为不维持和维持pH，维持pH为发酵前10h维持pH为7.0，发酵10h后维持pH为7.5 （用12.5%的氨水和5M的H₃PO₄） ，培养24h。

1.3　细胞生物量的测量

发酵液稀释一定倍数，使OD₆₀₀的值在0.1～0.5的线性关系，在600nm下测OD值，并乘稀释倍数得到OD₆₀₀。

1.4　酶活的确定

1.3.1　细胞悬浮物的制备

取2ml的培养液，4000g离心10min，沉淀用生理盐水洗1次，再离心，用10ml 25mM Tris-HCl （pH8.8）悬浮细胞。

1.3.2　PAL酶活性的测定

测定方法见文献11，一个酶活单位定义为每分钟转化1nmol L-苯丙氨酸成为肉桂酸的酶量。PAL比酶活表示为每毫克干重细胞的活力单位数。总酶活表示为每升发酵液的活力单位数。

2　结果与讨论

2.1　pH值对菌体生长的影响

在摇瓶发酵过程中，用2MNaOH调整发酵液pH值，使其始终控制在7.0左右（大肠杆菌最适生长pH为6.8～8.0） ，并设立对照（即不控制pH） ，观察菌体的生长情况。实验结果表明，当培养至24h后，控制pH菌体量和PAL酶活力明显高于对照（图1） 。不控制pH条件下，培养24h发酵液pH已经降到4.72，这种pH抑制了菌体的生长。结果说明pH对工程菌的生长以及产酶有重要的影响。

（1.控制pH值； 2.不控制pH值）

2.2　摇瓶发酵初始pH对PAL活性的影响

从图1的结果发现，pH对菌体生长影响很大，因此，通过适当提高培养基的初始pH来试图减小pH的影响。将发酵培养基的初始pH用2MNaOH分别调整为6.5、7.0、7.5、8.0。摇瓶发酵培养24h，结果如图2，当工程菌培养在初始pH为7.5的发酵培养基时，酶活力最高，而此时菌体量并未达到最高。随着发酵液初始pH的升高，发酵液终止pH也在升高，菌体量也在提高。当发酵液初始pH为8.0时，此时菌体量达到最高，但酶活却开始下降。结果表明，发酵液初始pH为7.5是菌体的最佳产酶pH。同时表明，适当提高培养基的初始pH有利于菌体生长和产酶。

图2　发酵液初始pH对PAL活性的影响

2.3　摇瓶发酵过程中控制pH对菌体生长及产酶的影响

从以上实验得出，pH对菌体生长及产物的生成影响很大，菌体的生长有其最适pH，同时产物的生成也有其最适pH，为了探讨在发酵过程中不同pH对菌体生长及产酶的影响，将发酵培养基的初始pH设定在7.5，并在整个发酵过程中监控pH的变化，当发酵液pH降到6.5左右时（大约培养10h后） ，分别用灭菌的2MNaOH以及5MH₃PO₄调整发酵液pH分别为5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0 ，并控制pH直到发酵结束，观察菌体生长及产酶量。

图3　pH对菌体生长及产酶的影响

结果如图3表明，随着控制发酵液pH的升高，菌体量和酶活都在升高，当pH控制在7.5左右时，菌体量达到最大。随着控制发酵液pH的继续升高，菌体量和酶活反而开始下降，表明当控制发酵液pH为7.5以上时，此时的pH值已经不适合大肠杆菌的生长，并开始抑制菌体的生长和产物的表达。从而表明，该重组大肠杆菌的最适生长和产酶pH都在7.5左右，控制过高的pH对于菌体生长以及产物表达反而不利。

2.4　发酵罐控制pH与不控制pH对菌体生长以及产酶的影响

在以上药瓶发酵基础上，利用5L发酵罐研究控制与不控制pH对菌体生长以及产酶的影响。结果如图4表明，在不控制pH时，重组菌在5～10h培养前期，菌体生长较快，但培养10h后，发酵液的pH下降，导致菌体生长缓慢，在培养至18h时，葡萄糖耗净，菌体开始利用乙酸等代谢副产物，从而使发酵液的pH又有所上升，但菌体量基本不再提高。而控制pH在培养的6～20h期间，生长非常迅速，不控制pH的生长趋势明显提高，在培养至20h时菌体量OD₆₀₀达到20左右，而不控制pH的最高菌体量达到15左右。控制pH比不控制pH菌体量提高了33%。

图4　发酵罐控制与不控制pH对菌体生长以及产酶的影响

不控制pH，菌体在培养6～16h时，菌体开始产酶，但趋势较缓慢，在培养16～18h时，酶活达到最高，为620U/L，而控制pH在培养6～18h期间产酶趋势增长较为缓慢，但这一时期菌体量却生长的较快。培养至18h后，菌体开始利用营养物质合成酶，从而使酶开始大量的合成，至24h时，达到最高，为820U/L。控制pH比不控制pH酶活提高了32%。

以上结果表明，pH对于工程菌的生长以及产物的表达具有重要的影响，在培养前期，由于工程菌需要大量的利用碳氮源来满足自身的生长需求，而培养基的pH也基本可以满足菌体对培养环境中pH的要求，从而菌体能够大量生长。当菌体生长到一定时期时，菌体开始合成酶，同时开始合成和分泌大量酸性副产物，如乙酸等，这些副产物使发酵液的pH值开始下降，开始抑制菌体的生长，到培养后期，培养基中的pH已经完全抑制菌体生长，从而使菌体过早的停止生长而进入衰亡期。此时发酵液的pH已经不利于酶的合成和稳定，从而导致酶活力迅速下降。因此，控制发酵过程中发酵液的pH，使菌体始终处于最佳的生长和产酶pH，以获得最高菌体量和酶产量是非常必要的。Ryan等^[12]在培养产β-内酰胺酶的重组大肠杆菌DB₂时，研究在控制三种不同pH （7.0、7.4、8.0）条件下菌体生长以及β-内酰胺酶产酶情况，结果表明，随着pH的增加，菌体的比生长速率在下降，但是，β-内酰胺酶的酶活和菌体量却是在pH为7.4时达到最高。表明维持过高的pH并不适合菌体生长和产物表达。 Pinar Calik等^[13]研究了重组大肠杆菌生产苯甲醛裂解酶时维持pH （5.0、6.4、6.7、7.0、7.2、7.8）与不维持pH （初始pH7.2）对菌体生长和苯甲醛裂解酶生产的影响，结果表明，当控制pH为7.8时，副产物乙酸的积累量是最高的，而此时的菌体量却是较低的，原因可能是由于当维持较高的pH时，胞外pH高于胞内pH，从而在胞内外形成了不利菌体生长的质子电化学梯度，导致菌体生长受到抑制。吴军等^[14]在培养rIL-工程菌K802时发现，适当提高发酵培养基的初始pH有利于减小乙酸的抑制作用，菌体量和产物表达水平都有一定幅度的提高。我们的研究也发现，当控制pH在7.5时，菌体的生长以及产物的表达是最高的。同时表明适当提高培养基的初始pH可以减少乙酸等有机酸的积累，有利于菌体生长和产物的形成。

参考文献：

[1] Koukol J，Coun EE. Metabolism of aromatic compounds in higher plants，IV，Purification and properties of phenylalanine deaminase of Horden vulgare. J. Biol chem，1961，236:2692～2698

[2] Jahuen W，Hahlbrock K. Differential regulation and tissue specific distribution of enzyme of phenypropanoid pathways in developing parsley seeding. Planta，1988，173:453～458

[3] Jen Rosler，Florian Krekel，Nikolaus Amrhein and Jurg Schmid. Maize phenylalanine ammonia -lyase has tyrosine ammonia -lyase activity. Plant Physiol，1997，113:175～179

[4] Sikora L A，Marzluff G A. Regulation of L-Phenylalanine ammonia lyase by L-Phenylalanine and nitrogen in Neurosporo Crassa. J Bacteriol，1982，150:1287～1292

[5] Marusich W C，Jensen A R. Induction of L-Phenylalanine ammonia lyase during utilization of phenylalanine as a carbon source or nitrogen source in Rhodotorula glutinis. Journal of Bacteriology，1981，146:1013～1019

[6] Orndorff SA，Constantino N，Stewart D. Strain improvement of Rhodotorule graminis for production of a novel L-Phenylalanine ammonia lyase. Appl Envirom Microbiol，1988，54:996～1002

[7] Watanabe SK，Hernandez-Velazw G，Iturbe-Chinas F. Phenylalanine ammonia lyase from Sporidiobolus

pararoseus and Rhodospordium torulides: application for Phenylalanine and tryrosine deamination. World J Microbiol Biotechnol，1992，8:406～410

[8] Ambrus CM.，Ambrus JL，Horwath C. Phenylalanine depletion for management of phenylketonuria: use of enzyme reators with immobilized enzymes. Science，1978，201:837～839

[9] EI-Batal. Optimization of reation condition and stabilization of phenylalanine ammonia lyase-containing Rhosotorula glutinis cells during bioconversion of trans-cinnamic acid to L-Phenylalanine. Acta-Microbiol Pol，2002，51:139～152

[10] Godwin B，D Cunha. Enrichment of phenylalanine ammonia lyase activity of Rhosotorula yeast. Enzyme and Microbial Technology，2005，36:498～502

[11]杨顺楷，李果龙，赵健身.酵母全细胞苯丙氨酸鲜氨酶（PAL）活性的紫外分光光度测定法[J].天然产物研究与开发，1990，1: 59～62

[12] Wen Ryan，Satish J. Parulekar，and Benjamin C.stark. Expression of β-lactamase by recombinant Escherivhia Coli strains containing plasmids of different sizes-effects of pH，phosphate，and dissolved oxygen. Biotechnology and Bioengineering，1989，34:309～319

[13] Pinar Calik，Pinar Yilgor，and Ayhan S. Demir. Influence of controlled -pH and un controlled -pH operations on recombinant benzaldehyde lyase production by Escherichia Coli. Enzyme and Microbial Technology，2006，38: 617～627

[14]吴军，于公义，冯尔玲.基因工程菌培养过程中乙酸的积累及其对工程菌生长和产物表达的影响.生物技术通讯,1996，7 （2） : 71～74