发酵大豆中的游离型大豆异黄酮的研究进展

发酵大豆中的游离型大豆异黄酮的研究进展

杨薇　赵树欣

（天津工业微生物重点实验室天津科技大学生物工程学院　天津　300222）

摘要：大豆异黄酮是豆科植物的一种次生代谢产物，具有抗氧化、抗肿瘤、抗消炎的作用，对心血管疾病有防治作用，能影响骨代谢，防止骨质疏松，还具有雌激素作用，用于减轻或避免女性更年期。大豆异黄酮一般以游离型和糖苷型两种形式存在。游离型大豆异黄酮的主要成分为大豆黄素（Daidzein） 、黄豆黄素（Glycitein）及染料木黄酮（Genistein） 。较糖苷型相比，游离型大豆异黄酮具有更高的生物活性，特别是染料木黄酮在人体发育过程中具有比染料木苷更强的抗乳腺癌和前列腺癌的作用。研究证明经微生物发酵后的大豆中，游离型大豆异黄酮的含量远远高于发酵前，可达到发酵前的20倍以上。这主要是由于大豆在发酵过程中糖苷型的大豆异黄酮被以β-葡萄糖苷酶不断催化水解，生成游离型的大豆异黄酮。现在人们主要使用高效液相色谱（HPLC） 、薄层层析（TLC） 、气相色谱（GC）等方法测定发酵后大豆中游离型大豆异黄酮的含量。就游离型大豆异黄酮的一些物理性质而言，用以提取发酵大豆中大豆异黄酮的方法不同，但主要都是通过过滤、离心、有机溶剂提取、柱层析、重结晶等操作方法来提取和纯化游离型大豆异黄酮。本文将对发酵大豆中的游离型大豆异黄酮的分析和提取方法做出概括性的介绍。

关键词：大豆异黄酮；游离型；发酵

大豆异黄酮是大豆等豆科植物生长过程中的一种次生代谢产物，具有抗氧化，抗肿瘤，抗消炎的作用，对心血管疾病有防治作用，能够影响骨代谢，防治骨质疏松，具有雌激素作用，用于减轻或避免女性更年期。大豆异黄酮在自然界中以2种形式存在，即糖苷型和游离型。游离型的大豆异黄酮较糖苷型具有更高的生物活性。在非发酵性大豆制品中，异黄酮只有极少量以游离形式存在，大约为总酮量的2%～3%，其中大部分又以β-葡萄糖苷的形式存在，主要包括大豆黄苷（Daidzin） 、黄豆黄苷（Glycitin）和染料木苷（Genisin）三种物质。此外，还有较少的异黄酮苷的乙酰化合物和丙二酰化合物。而在发酵性大豆制品中，异黄酮葡萄糖苷在β-葡萄糖苷酶的作用下，水解成为游离的大豆异黄酮，主要成分为大豆黄素（Daidzein） 、黄豆黄素（Glycitein）和染料木黄酮（Genistein）^[1]。研究表明，经过发酵的大豆中，游离型的大豆异黄酮的含量要远远高于发酵前，最高可以达到发酵前的20倍。而且大豆异黄酮的游离形式比糖苷形式的生物活性要高，特别是染料木黄酮在人体发育过程中具有比染料木苷更强的抗乳腺癌和前列腺癌的作用。

目前市场上销售的大豆异黄酮大多从脱脂豆粉中提取，由于对大豆异黄酮生理功能的研究不断取得新进展，市场对大豆异黄酮的需求量也在不断增长，据调查年需求量在1500吨，而目前的年产量为500吨，其中游离形式的异黄酮含量很低。尽管可以通过酸处理或酶（β-葡萄糖苷酶）处理，得到游离形式的异黄酮，也可以通过化学合成的方法得到游离型，但是生产成本都很昂贵。利用微生物发酵的方法生产大豆异黄酮，和化学合成、提取法相比，不但可以使产量大大增加，而且还可以降低成本，更有吸引力的是能直接生产游离型大豆异黄酮^[2]。本文将主要介绍发酵大豆中的大豆异黄酮的提取和分析方法。

1　大豆的发酵

目前已报道的可以产生游离型大豆异黄酮，特别是染料木黄酮和大豆苷（daidzein）的微生物有：浅玫瑰链霉菌（Streptomyces roseolus ATCC 31047） 、红色糖多孢菌（Saccharopolyspora erythraea ATCC 11635） 、嗜盐小单孢菌嗜盐亚种（Micromonospora halophytica subsp.halphytica ATCC 27596）和嗜盐小单孢菌黑色亚种（Micromonospora halophrtica subsp.nigra ATCC 33088）^[3]、黄暗色链霉菌（Streptomyces xanthophaeus MD865-C3）^[4]等。这些微生物都具有产生β-葡萄糖苷酶的特性，在以大豆为基质的培养基中进行发酵，能够产生游离型的大豆异黄酮。发酵需要在有氧条件下进行，在pH4.0～9.0，27～32℃发酵3～6d。整个发酵过程可以在摇床或发酵罐中完成。

2　发酵大豆中的游离型大豆异黄酮的提取方法

由于大豆发酵后，大豆中的许多糖苷形式的大豆异黄酮在发酵过程中会通过β-葡萄糖苷酶催化水解为游离形式的大豆异黄酮。与糖苷型相比，游离型的大豆异黄酮具有更高的生物活性，尤其是染料木黄酮与黄豆苷元，并被应用于食品、医药等方面。染料木黄酮为无色片状结晶，黄豆苷元为无色针状结晶^[5]。合成的黄豆苷元的熔点为320～321℃（分解）[6～8]，合成的染料木黄酮的熔点为295～296℃（分解）^[7～9]。游离型的大豆异黄酮水溶性最差，基本不溶于水，易溶于丙酮、甲醇、乙醇、乙酸乙酯等弱极性溶剂中。结合以上介绍的有关游离形式的大豆异黄酮的物理性质，下文简要介绍一些游离型大豆异黄酮的提取方法。

从发酵液中提取、分离、纯化大豆异黄酮的方法很多，基本都要用到过滤、离心、有机溶剂提取、柱层析、重结晶等操作。

Hazato等先把发酵液过滤，再把滤液倒入到Amberlite XAD-2树脂柱，用水洗柱后，活性部分用甲醇洗脱，活性洗脱物减压蒸发得一浆状物，这一浆状物用甲醇溶解，然后使用Sephadex LH-20柱，再用甲醇洗脱。从Sephadex LH-20柱上得到4个馏分，把第3个馏分用硅胶柱分离得到染料木黄酮，产量为lμg／ml。把第4个馏分上硅胶柱，用氯仿-甲醇（10∶1）洗脱，得到大豆苷元，产量为0.9μg/ml^[10]。

姜蓉等先把发酵液离心后，再把上清液用盐酸调pH到4，用乙酸乙酯提取，提取液经无水硫酸钠脱水后，减压浓缩得粗品。粗品经SephadexLH-20柱层析，甲醇洗脱收集黄色馏分，再用苯-丙酮（5∶2）作展开剂，进行两次制备性薄层层析，得到了大豆苷元和染料木黄酮^[11]。

Ogawara等把发酵液用盐酸调pH到2.0，然后3，O00r／min离心15min，上清液加入乙酸乙酯，3，000r／min再离心15min，把溶剂相用蒸馏水洗涤，然后把溶剂相干燥，上两次硅胶柱，再用制备性薄层层析得到染料木黄酮的粗品，再经重结晶得到纯品染料木黄酮，产量为0.24μg/ml^[12]。

Umezawa等把发酵液过滤，滤液用乙酸乙酯在pH2.0下萃取3次。湿菌丝饼用甲醇提取，然后把甲醇蒸发，残留物溶于pH8.0的水中，在pH2.0下用乙酸乙酯提取3次，把乙酸乙酯的提取物合并，减压下蒸发，得棕黑色浆状物。把此浆状物溶解于甲醇中，上硅胶柱，用氯仿—甲醇（50∶1）洗脱，分别收集活性馏分。把活性馏分在减压下蒸发干燥，溶解于甲醇中，上SephadexLH-20柱，用甲醇洗脱，把洗脱液蒸发干燥。干燥后的物质溶于甲醇，上硅胶柱，用氯仿—甲醇（100∶1）洗脱，把活性洗脱物蒸发，得到活性成分的粗晶体。然后用甲醇和苯的混合物重结晶，得到染料木黄酮，产量为89.2μg／ml^[13]。

Gyorgy等把丹贝（tempeh）粉用95%乙醇提取，浓缩成浆状物；浓缩后的浆状物用50%乙醇提取，再把溶剂蒸发掉；浓缩后的油状物用乙醚提取，再把乙醚蒸发；残留物用25%乙醇处理，从25%乙醇不溶部分得到大豆苷元和染料木黄酮的晶体^[14]。

3　发酵大豆中的游离型大豆异黄酮的分析方法

发酵后的大豆中，游离型大豆异黄酮的含量很高，占异黄酮含量的40%以上，甚至可达到100%，大约是发酵前的20倍，主要的3种游离型异黄酮为染料木黄酮、大豆黄素和黄豆黄素。目前，检测游离型大豆异黄酮的方法主要有高效液相色谱法（HPLC） 、薄层层析法（TLC） 、气相色谱法（GC）等方法。

3.1　高效液相色谱法（HPLC）

高效液相色谱法是目前测定大豆异黄酮研究工作中应用最为广泛的一种方法，此法具有测定样品范围广、样品制备步骤少、成本相对低、分离效率高、灵敏度高、测定结果准确、操作方便等特点，且有多种检测器可供选择。样品多采用不同浓度的甲醇、乙醇直接振荡提取、超声或回流提取后经酸或酶水解后进行测定，也有经柱层析分离之后测其分离液等方法。但该方法的不足之处在于检测时间较长，消耗流动相较多等缺点。该方法主要适用于大型企业和综合性科研机构^[15]。

张晓峰、李里特等使用日本岛津高效色谱仪LC-10A系列，色谱柱： 4.6mm×250mm，C₁₈，柱温40℃，进样量20μl，检测波长254nm，流动相0.1% （V/V）乙酸的乙氰溶液（溶液B） ，在0min～35min由20%升至40%，流量1ml/min。测得腐乳发酵过程中异黄酮糖苷的含量降低，异黄酮苷元的含量上升，后酵50天腐乳中总苷元（游离型大豆异黄酮）含量是酵前的20倍。在6%的食盐条件下，发酵过程中染料木酮苷酶解速度高于黄豆苷，在发酵30天染料木黄酮和黄豆苷元的含量分别达到局部峰值191.24μg/g （干物质）和106.65μg/g （干物质）^[16]。

P.E.Hessler，P.E.Larsen等在Synchropak RPP-100-25 （250×4.6 mm，10nm）色谱柱上（以C₁₈填料） ，以含有50%甲醇-50%醋酸铵为流动相进行梯度洗脱，检测波长为260nm，测得经大豆发酵后染料木黄酮的含量是发酵前的5～10倍^[17]。

郝征红所选检测色谱条件为：流动相MeOH-0.3%H₃PO₄（48∶52） （测定游离型异黄酮所用的流动相条件） ；柱温25℃；流速O.7 ml／min；检测波长260 nm^[16]。

张延凤等使用BECKMAN-ODS柱，流动相为水（0.01%三氟乙酸） :甲醇= 20∶80，流速1ml/min，检测波长为260nm，检测染料木黄铜的含量。线性范围为0.195～50 mg/L，日内精密度为0.45% ，日间精密度为1.2% ，平均回收率为99.5%^[18]。

姜铁夫等采用HPLC法，使用ODS-C18色谱柱，流动相:甲醇—水—磷酸（50∶50∶0.1），检测波长260nm。测得葛根黄豆苷元衍生物DZ18浓度在0～100μg/ml范围内，线性关系良好，r²= 0.9998。回收率在89%以上；日内、日间精密度均低于5 %。此方法为DZ18的药动学研究提供了可靠的检测手段^[19]。

米建萍等将食品样品经0. 50mol/L盐酸回流和乙醇提取大豆异黄酮后，采用甲醇-0.01mol/L乙酸铵溶液（pH=4.5） （60+40）作为流动相分离待测物质，等度洗脱，采用紫外检测器于254 nm波长下测定。结果染料木黄酮的检出限为0. 04μg/ml，大豆苷元为0. 05 μg/ml;样品的加标回收率为91.4%～113.1% ，日内和日间相对标准偏差分别为1.1%～2.8%和2.9%～5.1%^[20]。

3.2　薄层层析法（TLC）

薄层层析法具有取样量少、操作简便、分离效果好、结果准确等优点，适用于大豆异黄酮生产过程的中间物料和无精确度要求的产品检测，能较好地进行定性分析，但定量检测精度不高。

张海德等采用真空浓缩干燥酱油、乙酸乙酯热回流抽取酱油中黄酮物质并使用薄层层析法进行纯化、分离，采用硅胶GF₂₅₄做吸附剂（薄层板厚度为0.3mm） 、展开剂用三氯甲烷：甲醇= 6∶1 （V/V）的混合展开系统从提取物中分离出大豆黄酮、染料木素和大豆黄素^[15]。

P.E.Hessler，P.E.Larsen等在厚度为200mm，10×10cm的硅胶薄层板上点样，展开剂为氯仿—甲醇（10∶1） ，在紫外光下观察，染料木黄酮表现为一个很暗的斑点^[15]。

3.3　气相色谱法（GC）

气相色谱法具有低检测限、高效能、高选择性、高特异性、应用范围广等突出优点，但在测定黄豆苷和染料木苷时需制备衍生物，样品制备步骤较多，耗时长且仪器较为昂贵，从而限制了该法的推广应用。

Ligin J等，采用毛细管气质联用测定了坚果中的黄豆苷和染料木苷并以合成的黄豆苷和染料木苷为内标采用气质联用法对食物中的黄豆黄素和染料木苷在较宽浓度范围内进行了含量测定^[21，22]。

Joannou GE等采用毛细管气相色谱法和气质联用分离测定了尿样中的黄豆黄素和染料木苷^[23]。

Gooderham MJ等采用同位素稀释气质联用法对服用富含黄豆黄素食物人群的血浆中的异黄酮类物质进行了测定^[24]。

以上这些方法在游离型大豆异黄酮的检测方面都有较好的效果，当然也都各有优缺点，还需要进一步研究快速、方便、省时及操作费用小的分析方法，以指导游离型大豆异黄酮的研发。

4　结束语

现在，越来越多的人已经认识到大豆异黄酮的强大的生物活性，并且一部分人已经开始致力于研究开发大豆异黄酮中的最重要的活性组分，并已经初步证明游离型大豆异黄酮的生物活性较高，且更加容易被人体吸收。经进一步研究，人们在发酵后的大豆中可以得到比发酵前更多的游离型大豆异黄酮，虽然现在由于技术上的限制，未能将发酵大豆中的所有游离型异黄酮分离纯化，但相信随着科学技术的发展，通过微生物发酵方法生产的大豆异黄酮，特别是游离形式的大豆异黄酮，在食品、医药等方面的应用将会非常广泛。

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