壳聚糖固定糖化酶的研究

壳聚糖固定糖化酶的研究

侯红萍　曹彬

（山西农业大学食品科学与工程学院　太谷　030801）

摘要：以壳聚糖为载体，采用包埋法—交联法固定糖化酶。对其最佳固定条件及固定化酶的性质进行了研究。结果表明，最佳固定条件是：戊二醛浓度0.04 %，交联温度10℃，交联时间6小时，反应pH为4.6；固定化糖化酶的最适作用温度和最适pH分别为65℃和4.6。比游离酶的最适温度从60℃、pH由4.1分别提高5℃和0.5个单位。相对游离酶活为67.56 %，固定化酶的Km为0.91 %。固定化酶的机械强度得到很大提高，且在使用过程中不易溶解。

关键词：壳聚糖；糖化酶；固定化；戊二醛

目前，糖化酶在食品与发酵工业、医药工业、化学工业、环境保护和能源开发等各个领域的应用非常广泛，但游离酶在使用过程中存在一些弊端。例如，游离酶的稳定性较差，不能重复使用，并且产物的分离纯化困难。若将游离酶固定在一定载体上呈封闭状态的，并在一定的空间范围内连续的进行催化反应，可克服游离酶的不足之处，即固定化酶具有以下显著特点：①极易将底物与产物分开；②可以在较长时间内进行反复分批反应和柱装连续反应；③在大多数情况下，可以提高酶的稳定性；④酶反应过程可以加以严格控制；⑤产物中没有酶的残留，简化了工业设备；⑥较水溶性酶更适于多酶反应；⑦可以增加产物的收得率，提高产物的质量；⑧酶使用效率提高，成本降低。

本研究是以壳聚糖为载体，采用包埋-交联结合法对糖化酶加以固定。即以壳聚糖为载体先将糖化酶包埋固定，再加入戊二醛交联固定。通过戊二醛交联提高固定糖化酶的机械强度，并尽可能降低固定化以后酶活力损失。并对影响固定化的因素以及固定化酶的性质进行研究。

1　材料与方法

1.1　壳聚糖（脱乙酰度≥90.0%，黏度＜100cps）

上海伯奥生物科技有限公司生产。

1.2　固定化糖化酶的制备

取20ml浓度为20g/L的壳聚糖溶液，加入浓度为10g/L的游离糖化酶液5ml搅拌均匀，在一定温度下干燥制得固定化酶。以此固定化酶为二次固定的对象，加入适量的戊二醛在一定温度下，交联一定时间，制得固定化糖化酶。

1.3　固定化糖化酶活力的测定

以可溶性淀粉为底物，在一定的pH和温度条件下，以斐林试剂快速法测定。固定化酶活力的定义是： 1g固定化酶干胶在40℃、pH4.6的条件下，1h分解可溶性淀粉产生葡萄糖的毫克数。

1.4　酶活回收和相对酶活力的计算

偶联反应后，固定化酶所显示的活力占加入偶联液中酶的总活力的百分数为固定化反应的活力回收。

活力回收=（固相酶总活力/加入偶联液的总酶活力） ×100%

相对活力=（固定化了的酶活力/同样蛋白量自然酶活力） ×100%

2　结果与分析

2.1　固定化糖化酶最佳条件的确定

用L₉（3⁴）正交试验筛选制备固定化糖化酶交联反应的最佳工艺条件，其水平因子见表1，结果见表2。

表1　固定化交联反应最佳条件筛选因素水平

表2　交联反应最佳条件正交试验结果

从9个试验指标的结果可以看出，第2号试验的结果最好，其工艺条件是： A₁B₂C₂D₂。各列级差大小反映了同一因素不同水平时试验指标的变化幅度，变化幅度愈大，该因素对试验指标影响愈大，就愈重要。从表中的R值可知，pH值对固定化酶活力的影响是最重要的因素，其次是戊二醛浓度，再次是交联温度，最后是交联时间。

2.2　固定化糖化酶性质的测定

2.2.1　不同pH值对固定化酶活力的影响

从筛选出的最佳条件下交联制得固定化固定化酶，等量称取七份分别于pH3.1、3.6、4.1、4.6、5.1、5.6、6.1，25ml 2%淀粉溶液中，在45℃的恒温水浴摇床中保温反应1h，测定固定化酶的活力。结果见图1。

图1　pH对固定化酶活力的影响

从图1中可以看出，固定化酶活力随pH的逐渐增加先上升，后下降。在pH4.6处固定化酶的活力达到高。与原游离酶最适pH4.1，包埋固定化酶最适pH3.6相比明显偏高。这是由于交联作用使载体原来的带电性发生了改变，从而使载体周围的微环境pH发生了变化；并且酶由于多个基团被交联，被固定后酶的催化性质也有所改变。它们共同导致了交联后酶的最适反应pH发生偏移。

2.2.2　不同温度对固定化酶活力的影响

同样取一定量的上述固定化酶于pH4.6、25ml的2%的淀粉溶液中，分别在40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃的恒温水浴摇床中保温反应1h，测定固定化酶的活力。结果见图2。

图2　不同温度对固定化酶活力的影响

从图2中可以看出固定化酶活力变化的趋势，即随反应温度的增加有一个逐渐上升到下降的趋势，在65℃左右达到峰值。交联后酶的最适反应温度与原游离酶最适温度60℃相比，升高了5℃。这主要是由于固定化增加了酶结构型的牢固程度，阻挡了不利因素对酶的侵袭，并在一定程度上限制了酶分子的相互影响所导致的。

2.3　米氏常数K_m的测定

称适量最佳条件下制得的固定化酶，以浓度为0.2%、0.25%、0.33%、0.5%、1%的可溶性淀粉作为底物，分别在40℃、自然pH条件下保温10min后，立即测定酶活力，以10min的相对酶活力代表酶反应的速度，按Line weaver-Burk作图法以反应速度的倒数对底物浓度的倒数作图，所得直线在x轴上的截距即为-1/K_m。结果如图3所示。

图3　固定化对酶表观Km值的影响

在图3中，可求出固定化酶的K_m为0.91%。这比固定化酶的米氏常数K_m0.65%、游离酶的米氏常数K_m0.52%都大。

K_m作为特征常数仅与酶的性质有关，与酶的浓度无关。 K_m增大说明达到最大反应速度一半时所需底物的浓度就越大，酶对底物的亲和力就越小。交联后固定化酶的K_m最大说明其与底物的亲和力与包埋法固定化酶、游离酶相比最小。

3　结论

以壳聚糖为载体，采用包埋-交联结合法固定糖化酶的最佳工艺条件是：戊二醛浓度0.04 %，交联温度10℃，交联时间6小时，反应pH为4.6。固定化糖化酶的最适温度和最适pH分别为65℃和4.6。比游离酶的最适温度从60℃、pH由4.1分别提高5℃和0.5个单位。相对游离酶活为67.56 %，固定化酶的K_m为0.91 %。

参考文献：

[1]郭勇.酶工程（第二版） [M].北京：科学出版社，2004.179～189

[2]罗云波.食品生物技术导论[M].北京：中国农业大学出版，2002.149～151，171～182

[3]王家东，姜子明，曹彬，毕韬韬，侯红萍.固定化糖化酶的研究[J].中国调味品，2006，（03） :14～16

[4]田冶，焦延鹏，陈义康，李立华，周长忍.不同脱乙酰度对壳聚糖表面物理及吸附性能的影响[J].广州化学，2005，（06）

[5]罗贵民.酶工程[M].北京：化学工业出版社，2002.37～52

[6]天津轻工业学院，大连轻工业学院，无锡轻工业学院.工业发酵分析[M].北京:轻工业出版社，1980，18～20

[7]肖正华，张惠静，张梦军，管潇.壳聚糖在酶固定化中的应用[J].西南国防医药，2005，（03）

[8]江龙法，张所信，王为国.壳聚糖作为固定化酶载体的应用研究[J].现代化工，1999，（9）

[9]梁足培，冯亚青，孟舒献，李刚.壳聚糖及其衍生物在固定化酶中的应用进展[J].中国海洋药物，2004，（04）

[10]陈昆明，张墨玲，郗树清，王俊生，侯秉璋.戊二醛交联法制备壳聚糖固定化酶的改进研究[J].生物工程学报，1996，（S1）