基因传感器

12.5　基因传感器

12.5.1　概述

研究生命现象离不开获取和解析生物学信息，利用传感技术获取生物信息是生命科学发展的迫切需要。基因就是含特定遗传信息的DNA序列。基因控制着人类的生老病死过程。基因的研究带动了20世纪整个生命科学的迅速发展。可以预计，在21世纪相当长的时期内，基因研究仍将继续推动生命科学研究向纵深发展。基因检测不仅对生物学研究至关重要，而且对临床医学、环境监控、法学鉴定等领域具有极其重要的意义。

基因检测一般有直接测序和杂交检测两种方法。杂交法简单、易行。所谓杂交是指具有一定互补序列的核苷酸序列在液相或固相中按碱基互补配对原则缔合成异质双链的过程。

图12-17　DNA探针与靶序列的杂交

基因传感器，又称DNA传感器，即是基于杂交法。基因传感器的工作原理很简单:将已知核苷酸序列的单链DNA分子（ssDNA探针）固定在载体固体电极表面，使其与互补的靶（目标）序列杂交，形成双链DNA（dsDNA），再利用各种换能器对杂交信号进行转换、放大和检测（如图12-17所示）。杂交时，单链DNA探针与靶序列之间通过Waston-Crick效应形成双螺旋结构，由于这种双螺旋结构的形成具有很强的选择性，因此DNA探针能在含有多种非互补序列的混合物中识别出靶序列。

根据检测时杂交信号转换方式的不同，基因传感器可分为光学、电化学和压电等类型。

12.5.2　基因传感器的分类及原理

1.光学基因传感器

（1）表面等离子体共振（SPR）基因传感器

表面等离子体共振基因传感器通常是在几十纳米厚的金属（金、银等）表面固定一段靶基因片，当待测液中存在其配体（待测物）时，二者就发生结合，这将导致金属表面对入射单色光的反射率发生改变，进而引起单色光在液面与波导界面上折射率的改变。用光波导将折射率的变化传输给检测器而达到检测待测物的目的。由于该技术的灵敏性高，不需对探针或样品进行事先标记，成本低、简单，已成为目前研究的热点。表面等离子体共振基因传感器可用于实时追踪核酸反应的全过程，包括基因装配、基因合成延伸、内切酶对双链基因的特异切割。

将光波与表面等离子体耦合并使其发生共振，必须使用耦合器件。常用的耦合器件有棱镜型（Otto型和Kretschmann型）、光纤型和光栅型。

图12-18　SPR光纤基因生物传感器

（a）在线传输式；（b）终端反射式

SPR型光纤基因生物传感器有两种类型:一种是在线传输式，另一种是终端反射式。在线传输式SPR光纤基因生物传感器的结构如图12-18（a）所示，它是将一段光纤中的一部分外包层剥去，在光纤纤芯上沉积一层高反射率金膜。普通石英光纤一般直径为0.3μm，光纤内部可传播光线的范围为78.5°～90°。在此角度范围内，光线在光纤纤芯与包层的界面上发生全内反射。在沉积高反射率金膜的这一段纤芯中，光线同时发生反射和折射，渗透过界面的折射波将在金膜中引发表面等离子体，并在一定条件下产生共振。在光纤的出口端检测输出光强度与波长分布的关系，就可进行定量的分析。

终端反射式SPR光纤基因生物传感器的结构如图12-18（b）所示，其构造方法是，在光纤的一个端面上沉积一层银膜，厚度达300nm，制成微反射镜。将此端一段长5mm左右的光纤包层剥去，并在光纤纤芯上沉积50nm左右的金属膜。在光线传输过程中，当满足一定条件时，将会产生表面等离子体共振。共振光传输至端面处沿来路被反射回去。光线经过第二次共振后，传输到光纤光谱仪进行检测。该方式省略了流通池，可用于远距离测试。

采用棱镜型耦合器件，Jordan等人用SPR技术研究了金膜表面基因的杂交吸附及基因表面上链亲和素的固定，实时监测了单链基因和生物素标记的寡核苷酸互补序列的杂交反应。目前，纳米技术也被应用到SPR传感器中。首先将单链基因固定在金膜表面，然后将胶体金纳米粒子粘接在单链基因上，并将其引入样品池与互补基因相接触，发生杂交反应，通过金膜和金纳米粒子的电场耦合放大作用，极大地提高了测定基因的灵敏度。

（2）发光基因传感器

发光基因传感器根据发光机理的不同，可分为荧光、电化学发光和化学发光基因传感器，这种传感器通常采用标记技术对靶序列进行标记，标记物为荧光素或酶等。发光基因传感器的灵敏度很高。

图12-19为一种单分子显微荧光基因传感器。该传感器利用互补ssDNA之间的特异性相互作用固定被测ssDNA链。ssDNA链包含A和B两部分，B为待测的靶序列，A则与载体上的固定序列A′互补。通过A固定后，再利用与B序列互补的探针序列B′进行检测。此种类型的基因传感器称为“三明治型（夹心式）”基因传感器，其固定序列和探针序列上分别标记具有不同发射波长的荧光素F1和F2。结合成像技术，在F1的发射波长能看到的亮点为固定DNA序列，在F2的发射波长能看到的亮点为探针DNA分子。基于此，就能判断哪些检测DNA分子是通过非特异性吸附，而不是通过杂交结合在载体表面的。

图12-19　单分子显微荧光基因传感器

2.压电晶体基因传感器

将寡核苷酸固化在压电晶体振子表面，然后暴露在单链互补序列中，如图12-20所示。经过一段充裕时间的杂交后，振荡频率发生变化，检测其共振频率，即可获得被测物的信息。

1988年，Fawcett等首先利用压电谐振器对晶体电极表面固定的聚尿苷酸与溶液中的聚腺苷酸的互补杂交进行检测。固定化的核酸探针和互补的靶核酸进行杂交，固化在液体中完成，但频率的测定需在干燥状态下完成。后来随着液相压电传感器技术的成熟，通过现场监测杂交过程，使压电基因传感器更为简便和快捷；同时也可进行表面杂交过程动力学的研究，并为基因传感器的优化提供依据。这方面率先开展研究的是Okahato实验室，他们测定了10～30个碱基的寡核苷酸双链互补结合的平衡常数、结合及解离的速度常数等动力学参数以及表面的杂交结合量；通过改变探针的固定方法、探针和靶基因的长度、错配的碱基数、杂交温度、杂交液离子强度等因素，详细研究了传感器表面杂交过程的动力学特性。常规的压电传感器研究方法是把基因的一条链固定在电极上，只测定频率的改变，这样做不能消除液体的粘度、膜的粘弹性以及表面粗糙度等因素的影响。

图12-20　压电晶体基因传感器的原理

还有一类压电晶体基因生物传感器是根据压电晶体的声学特性来设计的。压电晶体表面经处理后将一段寡核苷酸固定在其表面，含有互补序列的杂交液流经该表面，在声波衰减长度区域内，共振频率的变化与杂交时基因依赖的黏度变化存在着一定的关系，根据声学阻抗分析就可以推算出被测物的量。Mcallister用压电声波平台模式延迟法研究基因杂交过程，只有完全配对的碱基序列才在传感器延迟线表面产生声波信号，从而达到了对靶基因的选择性识别。最近，有人提出以肽核酸（PNA）代替ssDNA作为探针分子修饰到金电极表面，研究表明，与ssDNA识别层相比，PNA识别层使基因传感器具有更优越的性能，包括更高的灵敏度和专一性，在室温和升温条件下杂交速度快且不受离子强度的影响，可使用更短的探针等。

压电生物传感器以操作简便快速、成本低、体积小、易于携带等特点，在分子生物学、疾病诊断和治疗、新药开发、司法鉴定等领域具有很大潜力。

与常规的核酸检测相比，压电基因传感器有以下特点:

（1）液相杂交检测　常规的核酸检测方法主要是固相杂交。压电基因传感器可以直接通过液相反应引起信号频率的变化，对靶物质的基因进行定量测定。

（2）可进行基因实时检测　把基因传感技术和流动注射技术相结合，对基因的动力学反应过程可以随时进行监测，并可以对基因进行定量、定时测定，实现了基因的在线和实时检测。

（3）灵敏度高　压电基因传感器是一种高灵敏度装置，灵敏度可以达到纳克量级，甚至可以达到皮克量级，并且可以对靶物质直接检测，实现了对低拷贝的核酸检测。

（4）该类传感器与其他类型的传感器相比，检测器体积小，便于携带，仪器及使用材料价格便宜，使用方便。

压电基因传感器有以下不足之处。

（1）响应时间　目前压电基因传感器的响应时间大部分在几十分钟到一小时以上。对于大批量样品测定，是其致命弱点。

（2）灵敏度　目前压电基因传感器的灵敏度与现行的PCR方法相比，还有一些差距，需要进一步研究开发。

压电基因传感器因基因杂交的缓慢动力学过程限制了其快速响应能力。提高灵敏度主要有两种力法:一种是利用PCR等扩增技术及基因嵌合剂的介入，提高检测的灵敏度；另一种研究趋势是在传感技术本身上挖潜力，如利用高频率的声表面波敏感元件。双调制技术制作的用于液相检测的压电基因传感器，利用特征阻尼理论，可从传感器总的频率变化中将液体引起的阻尼负载减去，从而计算出基因杂交引起的频率变化，既减少了误差，又可提高检测的灵敏度。

3.电化学基因传感器

采用电化学方法检测特定序列DNA，因其仪器简单、分析速度快而引起越来越多的重视。电化学基因传感器主要有电流型、电致化学发光型和电导型基因传感器。电流型是最常用的电化学基因传感器。

电流型电化学基因传感器由固定了单链DNA的电极和电化学活性识别元素构成，如图12-21所示。为了提高杂交的专一性，ssDNA（单链DNA）片段长度范围一般从十几个碱基到几十个碱基，通常采用人工合成的短链寡聚脱氧核苷酸，其碱基序列与样品中的靶序列互补。在适当的温度、pH值和离子强度条件下，固定在电极上的ssDNA与杂交缓冲溶液中的靶基因发生选择性杂交反应。如果样品中含有完全互补的DNA片段则在电极表面形成dsDNA（双链DNA），从而导致电极表面结构的变化，然后通过检测电极表面的电活性识别元素的电信号，达到识别和测定靶基因的目的。

图12-21　电流型电化学基因传感器原理

电流型基因传感器所使用的基底电极有玻炭电极、金电极、炭糊电极和裂解石墨电极等。目前DNA固定方法主要有化学吸附法、自组装膜法和共价键固定法。

12.5.3　基因传感器的发展趋势

不同的基因传感技术各具特色，但均存在不同程度的问题，有待于进一步完善。基因传感技术的发展主要有赖于以下几方面技术的进步:用于基因固定的载体表面修饰和基因探针固定化技术、界面杂交技术、杂交信号转换和检测技术及结果分析。

基因传感技术的进一步完善，首先需要研究新的基因探针固定方法，除探索新的固定化反应和筛选新的载体材料外，还必须考虑探针在载体表面的定向、探针密度和多点吸附等因素的影响以及表面固定化探针的准确定量。聚合膜虽然很容易用于固定DNA探针，但由于受扩散和小分子吸附等因素的影响，使其应用受到限制，不过现在已有了改善。单分子层自组装膜灵敏，响应快，容易控制探针密度，但一般不够稳定，难于反复再生循环使用。长链DNA探针的共价键合固定一直是个难题，原因是对其进行功能基因的直接衍生较困难，而将其直接共价固定又因表面反应而难于进行。这些问题都需努力寻求新的方法加以解决。

基因传感器应用的最重要方面之一，就是利用分子杂交检测特定序列DNA的突变。虽然大部分基因传感器都可区分出非互补序列，但要识别只有一个碱基突变的序列，尤其是长片段的单个碱基突变的识别十分困难。原因是长片段单个碱基的突变所导致的差别甚微，难于区分，对此亟需进一步深入研究。同时，还需建立DNA表面杂交模型，解释一系列相关热力学和动力学参数变化的规律。

基因传感器杂交信号的有效转换问题也有待深入研究。大部分电化学基因传感器的应用受到电活性杂交指示剂的限制，今后需要寻找能识别特殊序列结构，如错配碱基序列的杂交指示剂。虽已有大量利用DNA本身的电化学反应进行检测的无指示剂电化学基因传感器的报道，但正如前面所述，此检测方法不甚严格。但无论怎样，无标记的基因传感器仍是研究者致力追求的目标之一。尽管如此，标记技术仍将是信号转换中所采用的具有挑战性的技术。压电基因传感器不仅简便，可提供大量信息，而且能小型化，具有一定的应用前景，但在溶液中晶体频率受到多种因素的影响，需进一步深入研究。光学基因传感器灵敏度高，特别是荧光传感器，结合成像技术以及共振能量转移，各向异性和寿命测量，能在活体检测中得到应用。若能降低仪器成本，SPR基因传感器的应用前景将非常广阔。

总之，基因传感器的研究和应用涉及微电子学、界面化学、分子生物学以及分析化学等多个学科的知识，需全面加以考虑。预计在不太长的时间内，将可望出现真正实用化的基因传感器。

习题与思考题

12-1　什么是生物传感器？生物传感器主要有哪些类型？

12-2　简述生物传感器的原理。

12-3　什么是生物敏感膜？

12-4　简述酶传感器的工作原理。

12-5　简述免疫传感器的工作原理。标记酶免疫传感器的工作原理主要有哪两种？

12-6　什么是细胞传感器？

12-7　简述基因传感器的工作原理。