任务2.1理论基础

任务2.1　理论基础

2.1.1　普通光学显微镜的基本构造

显微镜的种类繁多，外形特征各异，但其功能基本相似，主要分为光学显微镜和电子显微镜两种。其中光学显微镜又分为普通光学显微镜、暗视野显微镜、相差显微镜、荧光显微镜等；电子显微镜分为透射电子显微镜、扫描隧道显微镜和扫描电子显微镜等。教学上常用的是普通光学显微镜。本模块主要讲授普通光学显微镜。

普通光学显微镜（图2.1）是由机械系统和光学系统两部分组成。

图2.1　光学显微镜机械系统和光学系统

1）机械系统

机械系统包括镜座、镜臂、载物台、转换器、镜筒及调节装置等。

①镜座：也称为底座，位于最底部，是显微镜的最下部位，起支撑显微镜的作用。

②载物台：又称为镜台或平台，是位于物镜转换器下方的方形平台，是放置被观察玻片标本的地方。载物台上装有前后左右移动的推进器或弹簧夹，载物台中央有通光孔，供光线通过。

③镜臂：支撑镜筒，是显微镜移动时手握的部位。

④转换器：又称为物镜旋转盘，是安装在镜筒下方的一圆盘状构造，用来装载不同放大倍数的物镜，其下有3～4个孔。

⑤调节装置：也叫调焦器，由粗、细两个螺旋组成，位于镜臂基部，起调节焦距的作用。升降载物台（转动粗、细调）可清晰地观察标本。

2）光学系统

主要包括目镜、物镜、聚光器、集光器、电源开关和灯泡等，它是显微镜的主要组成部件，使被检物体被放大，形成物体放大图像。

图2.2　目镜镜头

（1）目镜

目镜也称为接目镜（见图2.2），在镜筒的最上端，起着将物镜所放大的图像进一步放大的作用，并把物像映入观察者的眼中。目镜一般有三种（5×、10×、15×），由两块透镜组成，上面一块称接目透镜，决定放大倍数和成像的优劣，下面一块称为场镜或会聚透镜，它使视野边缘的成像光线向内折射，进入接目透镜中，使物体的影像均匀明亮而清晰。

（2）物镜

物镜也称为接物镜（见图2.3），安装在物镜转换器下方。每台光学显微镜一般有3～4个不同倍率的物镜（4×、10×、40×、100×，其中100×为油镜）。物镜倍数的大小决定着光学显微镜分辨率的高低，显微镜质量好坏也主要由物镜来决定。

图2.3　物镜的性能参数及工作距离

注：两箭头间距离为工作距离，单位为mm。

（3）聚光器

聚光器又称为聚光镜，安装在载物台下方，其作用是把平行的光线聚焦在标本上，增强亮度，使物像明亮清晰。为了保证聚光镜的焦点在镜筒正中，可以使用聚光镜上的调节器来调节聚光镜的上下，以适应使用不同厚度的玻片，同时也能保证焦点落在被检标本上。

此外，聚光镜上装有虹彩光圈开关，通过调整光圈孔径的大小，可以调节进入物镜光线的强弱。

（4）滤光片

滤光片是塑料或玻璃片再加入特种染料做成的，红色滤光片只能让红光通过，如此类推。玻璃片的透射率原本与空气差不多，所有色光都可以通过，所以是透明的，但是染了染料后，分子结构变化，折射率也发生变化，对某些色光的通过就有变化了。比如一束白光通过蓝色滤光片，射出的是一束蓝光，而绿光、红光极少，大多数被滤光片吸收了。蓝光的波长为450～500nm，相比日光可以较好地提高显微镜的分辨率。

（5）电源开关

安装在镜座后方或两旁，同时还可以调节光源的大小。

2.1.2　普通光学显微镜的光学原理

1）光学显微镜成像的原理

由灯泡发出的光线经聚光镜会聚在被检标本上，使标本得到足够的照明，由标本反射或折射出的光线经物镜进入，通过与水平面倾斜45°的棱镜，将光汇聚到目镜的焦平面上，即在目镜的视场光阑处，形成放大的侧光实像，该实像再经目镜的接目透镜放大成虚像，所以人们看到的是虚像（图2.4）。

2）光学显微镜的基本参数

（1）显微镜的放大倍数

被检物体经显微镜放大后的倍数是物镜的放大倍数和目镜放大倍数的乘积。如用放大40倍的物镜和放大10倍的目镜，其总放大倍数是40×10倍＝400倍。

（2）分辨率

物镜前面发光点发射的光线进入物镜的角度称为开口角度。透镜的放大率与开口角度成正比，与焦距成反比。数值孔径（NA）是光线投射到物镜上的最大开口角度一半的正弦值和折射率（指光通过标本与物镜间的介质时产生的）的乘积，即：NA＝n×sinα（见图2.5）。

图2.4　光学显微镜的成像原理

图2.5　数值孔径示意图

NA为数值孔径，n是介质折射率，α为最大开口角度的半数。由于介质为空气时n＝1，α最大值只能到90°（实际上α值不可能达到90°），sin90°＝1，所以在干燥系下物镜的数值孔径都小于1。使用油镜时，物镜与标本间的介质为香柏油（n＝1.515）或液体石蜡（n＝1.52），不仅能增加照明度，更主要是增大了数值孔径。目前技术下，最大的数值孔径为1.4（表2.1）。

表2.1　物镜的放大倍数与数值孔径

评价一台显微镜的质量优劣，不仅要看其放大倍数，更重要的是看其分辨率。分辨率是指显微镜能够辨别发光的两个点或两根细线间最小距离的能力，该最小的距离称为鉴别限度（R）：

R＝λ/2nsinα＝λ/2NA

R为鉴别限度，λ为光波波长。日光的波长λ＝0.5607～0.6μm，如果用NA＝1.4的物镜，则R＝0.22μm，这表示被检物体在0.22μm以上时可被观察到，若小于0.22μm就不能观察到图像。由此可见，R值愈小，分辨率愈高，物像愈清楚。所以，我们可以减低波长、增大折射率和加大镜口角来提高分辨率。

（3）工作距离

工作距离是指观察标本最清晰时，物镜透镜的小表面与标本之间（无盖玻片时）或与盖玻片之间的距离。物镜的放大倍数越大，其工作距离越短，油镜的工作距离最短，约为0.2mm。所以使用油镜时，要求盖玻片的厚度为0.17mm。虽然不同放大倍数的物镜工作距离不同，但生产厂家已进行校正，使不同放大倍数物镜转换时，都能观察到标本，只需进行细调焦便可以使物像清晰明亮。

（4）目镜的放大倍数

根据计算，显微镜的有效放大倍数是：

E×O＝1000×NA

E＝1000NA/O

注：E为目镜放大倍数，O为物镜放大倍数

根据上式可知，在与物镜的组合中，目镜有效的放大倍数是有限的，过大的目镜放大倍数并不能提高显微镜的分辨率。如用90×，NA为1.4的物镜，目镜有效的最大倍数是15×。

知识链接

关于显微镜

显微镜的正确使用、维护与保养方法非常重要。关于显微镜这一贵重精密的光学仪器，我们还应该了解更多的内容，现简单介绍如下：

1）显微镜的维护和保养

显微镜是贵重精密的光学仪器，正确的使用、维护与保养，不但使观察物体清晰，而且还能延长它的使用寿命。

①显微镜应放置在通风干燥，灰尘少，不受阳光直接曝晒的地方。不使用时，用有机玻璃或塑料布防尘罩罩起来。也可套上布罩后放入显微镜箱内或显微镜柜内，并在箱或柜内放置干燥剂。

②显微镜要避免与酸、碱及易挥发具有腐蚀性的化学物品放置在一起，以免受损。

③从显微镜箱或柜内取出或放入显微镜时，应一手提镜臂，另一手托镜座，让显微镜直立，防止目镜从镜筒中脱落。

④显微镜的目镜、物镜、聚光镜和反光镜等光学部件必须保持清洁，防止长霉，只能用擦镜纸擦拭，不能用其他物品或手擦拭。

⑤用油镜观察后，先用擦镜纸擦去镜头上的油，然后用擦镜纸蘸少许清洁液或二甲苯擦拭，最后用干净的擦镜纸擦干。清洁液或二甲苯用量不要过多，以免溶解胶合透镜的树脂，使透镜脱落。

⑥显微镜是精密的实验设备，一旦镜头损坏不能随意拆开，必须请专业人员维修。

2）其他类型的光学显微镜

（1）暗视场显微镜

用暗视场显微镜能观察到小于4～200nm的微粒子，分辨率要比普通显微镜高50倍。在构造上，暗视场显微镜应用丁达尔现象装配了一种特殊聚光器——暗视场聚光器，使入射光束从聚光器斜向照明被检物品，这是暗视场显微镜与普通显微镜的主要不同点。由于照明光线与显微镜光轴形成较大的角度通过物场和因聚光器的特殊构造，照明光线在聚光器顶透镜（或盖片）的上表面发生全反射，致使照明光线不能入射物镜之内，但是，样品被照明并发出反射和散射光。镜检时，因不能直接观察到照明光线，与光轴垂直的平面视场暗黑，在深暗的背景上能清晰地看到由散射光和反射光形成的明亮的物体影像，物像与背景造成极大的反差（见图2.6）。视场内的样品被斜射光线照明，可从样品各种结构表面散射和反射光线，看到许多细胞器的明亮轮廓，如细胞核、线粒体、液泡以及某些内含物等。如果是正在分裂的细胞，其各类纺锤丝和染色体亦可看见。

图2.6　暗视场显微镜下的图像

（2）相差显微镜

由于活细胞多是无色透明的，光线通过活细胞时，波长和振幅都不发生变化，在普通光学显微镜下，整个视野的亮度是均匀的，所以我们不能分辨活细胞内的细微结构。而相差显微镜能克服这方面的缺点，利用相差显微镜观察活细胞是最好的方法。

相差显微镜（或称相衬显微镜）的形状和成像原理与普通显微镜相似。不同的是相差显微镜具有专用的带环状光阑的聚光镜和带有相板的相差物镜。当光线经过相差聚光器、样品、相差物镜，将光束分成两部分，一部分是样品结构的折射光，另一部分为不受样品影响的光，经过相板，二者干涉，形成干涉图像。由于两束光的相位接近λ/2（半波长），相差显微镜可使光的相位变化转变为振幅变化，这样就可以见到反差分明的图像（见图2.7）。相差显微镜适于观察较透明的或染色反差小的细胞组织。

图2.7　相差显微镜下的图像