任务3.2马铃薯-葡萄糖培养基的配制技术

任务3.2　马铃薯-葡萄糖培养基的配制技术

1）实训目的

理解培养基制备的基本原则，掌握PDA培养基制备的基本方法和操作技术。

2）实训材料、仪器

马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂15～20g，水1000mL。

3）实训步骤

（1）材料的准备

按配方准确称量各营养物质。然后将马铃薯去皮、挖掉芽眼后称量200g，切成1cm见方的小块。琼脂剪碎后用水浸泡备用。

（2）熬制及定容

将切好的马铃薯块加1000mL水后放入电饭锅中，煮至酥而不烂。立即用双层纱布过滤，取滤汁，放在电饭锅中加入葡萄糖。在沸腾状态下加入琼脂，不断搅拌，直到琼脂完全融化为止，定容至1000mL。

（3）分装

用试管架分装，培养基的分装量为试管长度的1/5～1/4，培养基不能沾污试管口（图3.1）。

（4）包扎

培养基分装结束后，试管应立即塞棉塞，棉塞松紧适度，1/3在管外，2/3在管内。7～10支试管捆在一起，棉塞上包好防水纸，直立放入高压灭菌锅中。

（5）高压灭菌

将装入了培养基的试管在锅中1.0～1.5kg/cm²压力下维持20～30min。灭菌过程中应排除冷空气。

（6）制作斜面

灭菌结束后，锅盖开1/5的小缝，用余热烘干报纸和棉塞，然后在工作台面上摆斜面（图3.2），斜面长是试管总长的1/2～2/3。

图3.1　分装试管的装置

图3.2　摆平面

（7）检验及保存

经过无菌检查后放入5～7℃冰箱中保藏备用。

4）注意事项

在高压灭菌过程中采用两次排除冷空气的方法，可以有效地保证灭菌效果。

知识链接

食品环境中的极端微生物

自然界中，一些在以前被人们认为是生命禁区的高温、低温、高酸、高碱、高压或高辐射强度等极端恶劣环境中仍然生活着微生物，它们统称为极端环境微生物或简称为极端微生物。

1）嗜盐微生物

嗜盐微生物指那些一定浓度的盐为菌体生长所必需，且只有在一定浓度的盐溶液中才生长得好的菌类。嗜盐菌也常出现在高盐食物中，如腌鱼、海鱼和咸肉。近年来，我国陆续从进口咸鱼、海鱼中分离出嗜盐性弧菌，有关咸鱼中毒事件也时有发生。

某些嗜盐菌体内含有丰富的类胡萝卜素等成分，有望用于开发保健食品。嗜盐菌在高盐污水处理方面也将发挥重要作用。

2）嗜热微生物

嗜热微生物生长的环境有热泉（温度可达100℃）、草堆、地热区土壤及海底火山附近等。细菌是嗜热微生物中最耐热的。1983年，在太平洋底部发现的可生长在250～300℃高温、高压下的嗜热菌更是生命的奇迹。

在食品加工环境中，嗜热微生物可存在于排放冷却水中，也可以残存于经过高温灭菌牛乳或其他食品中。食品加工中最重要的嗜热菌有芽孢杆菌属和梭状芽孢杆菌属。

在基因工程中，嗜热微生物可为基因工程菌的建立提供特异性基因。从嗜热菌中提取出来的一些耐高温酶类，如DNA聚合酶，也是生物工程不可缺少的重要工具。在发酵工业中，可以利用嗜热微生物耐高温特性，提高反应温度，增大反应速度，减少中温杂菌污染的机会。

3）嗜冷微生物

嗜冷微生物主要分布于极地、冰窖、高山、深海、冷冻土壤等处，现在发现的嗜冷微生物主要有针丝藻和微单胞菌等。

嗜冷微生物根据其生长温度特性可分为两类：一类是必须生活在低温条件下且最高生长温度不超过20℃，最适生长温度在15℃，在0℃可生长繁殖的微生物称之为嗜冷菌。另一类其最高生长温度高于20℃，最适生长温度高于15℃，在0～5℃可生长繁殖的微生物称之为耐冷菌。耐冷菌比嗜冷菌分布更加广泛，可从储存在冰箱中的肉、奶、蔬菜和水果中分离得到。

耐冷菌的存在往往是造成低温保藏食品腐败的主要根源。在0～7℃之间，主要是革兰氏阴性菌如单核李斯特菌、沙门氏菌、微单胞菌和弧菌等造成食品的腐败和变质；在低于－18℃的冻藏温度下，酵母和霉菌比细菌更有可能生长。在食品中，微生物生长的最低温度记录是－34℃，它是一种红色酵母。

嗜冷微生物在工业和日常生活中具有许多潜在的应用价值。一是低温发酵可生产出许多风味食品，且可节约能源及减少嗜温菌的污染；二是分离自嗜冷菌的脂酶、蛋白酶等在食品工业和洗涤剂中具有巨大潜力；三是从海洋嗜冷菌分离的生物活性物质可用于医药和食品等。

4）耐辐射微生物

从以杀菌为目的进行辐射处理的食品、饲料等样品中，可分离得到各种耐辐射细菌。我国就曾报道在放射性元素环表面有抗辐射细菌的存在。

耐辐射微生物只是对高辐射环境具有耐受性，而不对辐射有特别嗜好。研究耐辐射微生物，一是可能为解决日益严重的因辐射过量所致疾病的治疗提供新的线索；二是辐射灭菌已被确定为一种理想的冷杀菌方式，而耐辐射菌是辐射保藏食品腐败的主要原因。

微生物分析及相关技术

微生物的分析检测包括定量和定性两个方面。定量是指微生物的总体数量的检测；定性则是指根据微生物表现出的各种形状特征，对微生物的种类进行分类鉴别。

1）传统微生物检测技术

（1）分离纯化

从混杂的微生物群体中获得只含有一种或某一株微生物的过程，称为微生物的分离纯化。平板分离法普遍用于微生物的分离与纯化，选择适合待测微生物生长的条件，或加入抑制剂造成只利于该微生物生长的环境，从而淘汰不需要的微生物。

（2）菌落计数法

菌落计数法是把定量样品中的微生物经过稀释后接种于固体培养基上，经过培养，根据培养基上出现的菌落数检测样品中的微生物含量。由于只有活细胞才能在培养基上形成菌落，因此该法属于活菌计数法。

标准平板计数法是食品工业中检测菌落形成单位数量的最常用的方法。

（3）显微镜直接计数法（又称全数法）

显微镜直接计数法可以分为两类：一类称为涂片染色法，即将已知体积的待测材料均匀地涂布在载玻片的已知面积上，经过固定染色后，在显微镜下计算染色涂片上的细菌数。另一类则称为计数器测定法，即用特制的细菌计数器或血球计数器进行计数。

（4）形态学特征

形态学特征可以分为个体特征和群体特征两个大类。个体特征主要是指微生物个体的情况，如细菌细胞的构造、革兰氏染色反应、能否运动、有无芽孢和荚膜、芽孢的大小和位置、放线菌和真菌的繁殖器官的形状、构造，孢子的数目、形状、大小、颜色，等等。

群体特征通常是指微生物在一定的固体培养基上生长的菌落特征，主要包括外形、大小、光泽、黏稠度、透明度、边缘、隆起情况、质地、气味，等等。

（5）生理生化反应特征

微生物的生理生化反应特征一是包括对各种碳源、氮源的利用能力，能量的来源，对生长因子种类和数量的要求，等等。二是主要测定微生物在生长过程中产生的某类特殊的生成物。如在细菌鉴定时常测定被检测菌是否产生硫化氢、吲哚、醇，能否还原硝酸盐，能否使牛奶凝固，等等。

2）现代微生物检测技术

（1）微量生化系统检测

自20世纪70年代以来，国内外陆续出现了许多简便的生化试验方法，这些方法的特点是具有快速性、准确性、微量化和操作简便等优点。在微量生化试验的基础上再配制一套由计算机编码的细菌鉴定手册，就可以对某类细菌进行大量的菌种鉴定工作。如国外商品化的API-20、Enterotube等，国内上海市卫生防疫站建立的SWF（A）发酵性革兰氏阴性杆菌鉴定系统，也取得了良好的使用效果。

（2）放射测量法

根据细菌在生长繁殖过程中代谢碳水化合物产生CO₂的原理，把微量的放射性14C标记引入碳水化合物或盐类等底物分子中，细菌生长时，这些底物被利用并释放出放射性的14CO₂，然后通过自动化放射测定仪器测量14CO₂的含量，从而根据14CO₂含量的多少来判断细菌的数量。

（3）基因芯片

基因芯片又称DNA微列阵，是指将许多特定的寡居核苷酸片段或基因片段作为探针，有规律地排列固定于支持物上形成的DNA分子列阵。芯片与待测的荧光标记样品的基因按碱基配对原理进行杂交后，在通过激光共聚焦荧光监测系统等对其表面进行扫描，即可获得样品分子的数量和序列信息。它主要是基于近年来的一种全新的DNA测序方法之一的杂交测序法应运而生的。

（4）凝集反应

细菌、血细胞等颗粒性抗原悬液中加入相应抗体，在适量电解质存在的条件下，抗原抗体发展特异性结合，进一步凝集成肉眼可见的小块，称为凝集反应。利用凝集反应，从而可以用已知抗血清检测未知的抗原，等等。

动物实验模型

实验动物在食品微生物学的研究中具有重要地位。利用实验动物可以进行食品病原菌的分离鉴定、毒力的检测、分型等工作。同时，也能对食品微生物所产生的功能因子等进行生物学效应的测定等研究。

1）食物中毒性细菌、毒素的动物检测

食物中毒菌是指食物中的中毒性细菌，如沙门氏菌、致病性大肠杆菌、魏氏梭菌、蜡样芽孢杆菌、副溶血性弧菌、金黄色葡萄球菌、肉毒梭菌等和它们所产生的毒素。在各种食物中毒中，细菌性食物中毒的比例是最高的，属于最常见的食物中毒。

（1）金黄色葡萄球菌肠毒素的动物测定法

将从食品中分离的菌株的肉汤培养物滴数滴于杜尔曼培养基上，置10%CO₂环境中，37℃培养72h，于培养基中加入无菌生理盐水10mL，捣碎琼脂成粥状，然后离心1h，3000r/min，除去琼脂和细菌，取上清液置沸水中加热30min。

选体重350～550g的幼猫，腹腔注射上述培养液3～5mL。4h内，幼猫出现不适，呕吐，腹泻或体温升高，或出现死亡现象。也可口服10～15mL滤液，结果相同。

（2）副溶血性弧菌的动物检测法

将符合副溶血性弧菌生化反应的菌株接种在3.5%氯化钠胨水中培养16～18h，小鼠腹腔注射0.3mL，观察2～3d，死亡小鼠剖检和分离培养。测定毒力时，可按不同计量（0.3mL，0.1mL，0.03mL，0.01mL）接种小鼠腹腔，每个计量接种3只小鼠，观察发病及死亡情况。

2）食物感染性微生物的动物检测法

某些病原微生物在食品的生产加工过程中带入，在人们食用时可引起食物感染。较为常见的有单核细胞增多性李氏杆菌、炭疽芽孢杆菌、结核分支杆菌、布氏杆菌、猪丹毒杆菌等。

（1）单核细胞增多性李氏杆菌小鼠毒力试验

将食品中分离的菌株接种到10mL胰酪胨大豆酵母浸膏肉汤中，35℃培养一天，离心取上清液。腹腔注射小鼠，观察一周内小鼠死亡情况。

（2）炭疽芽孢杆菌动物试验

用被检样品悬液或肉汤培养物0.1～0.2mL，接种于小鼠皮下，接种后18～96h，小鼠发病死亡。剖检时，在接种部位皮下，可见有严重的胶样浸润。再取小鼠的心血做涂片染色镜检和分离培养鉴定。

（3）布氏杆菌动物试验

选择300～450g豚鼠2只，采血分离血清，做试管凝集反应，阴性者可使用。取血清、乳汁等待检样品3mL，制成生理盐水悬液3mL，注入豚鼠皮下。4周后，采血清2～5mL，分离血清，做试管凝集反应，阳性者，剖检取肝脏、淋巴结等做细胞学试验。

3）真菌毒素的动物试验

（1）常见食品真菌产毒培养方法

常见的方法可举例如下，如黄曲霉毒素，将产毒菌株制成悬液，接种在葡萄糖硝酸铵培养基或大米培养基中，于28℃温箱中培养20d即可。如T-2毒素，将产毒菌种接种在PSC（察氏培养基中附加1%蛋白胨）中，于8℃培养30d，即可获得大量T-2毒素。

（2）家兔皮肤试验

关于家兔皮肤试验，需注意三点。一是毒素的提取。取干燥真菌培养物200～300g，装入洁净的500mL玻璃三角瓶中，随后加入乙醚（分析纯）至淹没检样1cm左右，盖紧瓶塞，在振荡器上振荡30min，然后用滤纸将乙醚提取液滤出，弃残渣，再将乙醚挥干，即可获得油状的粗制毒素。对照提取物用玉米面依上法照样提取。

二是毒素的测定。在家兔的胸或腹部两侧，用剃刀细心将毛剃光（切勿剃伤皮肤），剃毛面积约为4cm²，然后将粗制毒素和对照提取物分别用棉花涂于剃光的两侧皮肤上，每天涂抹两次，共涂3d，观察结果。

三是结果判断。在判断结果时，要与对照涂抹部位仔细比较，一般轻度充血，可视为疑似（±）；局部严重充血者（＋）；局部呈现红肿者（＋＋）；局部发生坏死至后期结痂者（＋＋＋）。上述方法适用范围是镰刀菌毒素测定。

其他还有多种真菌毒素的动物试验方法，如小白鼠皮下注射法、小鼠灌胃法、鸭雏灌胃试验法等，这里就不一一介绍。