任务5.4液体石蜡保藏法

任务5.4　液体石蜡保藏法

5.4.1　液体石蜡保藏法

1）实训目的

①了解液体石蜡保藏法的原理。

②学习并掌握液体石蜡保藏法的操作步骤。

2）实训材料、仪器

①菌种：待保藏菌种（要求菌体或孢子生长良好），对能利用烷烃为碳源的菌株不能采用此法保藏。

②培养基及试剂：待保藏菌种用相应培养基、液体石蜡（要求相对密度0.845，馏出温度340℃，分析纯）。

③仪器及其他用具：无菌吸管、酒精灯、接种环、三角瓶、试管胶塞、超净台、恒温培养箱、普通冰箱等。

3）实训步骤

液体石蜡或称矿物油，用它保藏菌种也比较简便易行，它是斜面低温保藏法和穿刺培养的辅助方法。此法是在需要保藏的培养物上覆盖一层已灭菌的液体石蜡，液体石蜡可防止因培养基水分蒸发而引起菌体死亡，还可阻止氧气进入，使好气菌不能继续生长，以延长菌种的保藏时间。

（1）石蜡覆盖斜面保藏

石蜡覆盖斜面保藏方法的步骤如下：

①液体石蜡。选用优质无色、中性、相对密度为0.8～0.9g/cm³的液体石蜡，装入三角瓶中，加棉塞，用防潮纸包好，9.8×10⁴Pa灭菌30min取出，置40℃温箱蒸发水分，或于110～170℃烘箱烘去水分，经无菌检查后备用。

②菌种培养。将需要保藏的菌种接种到适宜的培养基斜面上培养（斜面宜短，最好不要超过试管的1/2），以得到健壮的菌体细胞。

③灌注石蜡油。在无菌条件下，用无菌吸管吸取已灭菌的液体石蜡，注入已培养好的新鲜斜面菌体细胞上，以高于斜面顶端1cm为宜，使菌体与空气隔绝。

④保藏。将已灌注液体石蜡的菌种斜面以直立状态置低温（4℃左右）干燥处保藏。

⑤恢复培养。在移接或再培养时，先沿试管壁倒去附在菌体上的液体石蜡，将菌体移接到适宜的新鲜培养基上，生长繁殖后，再重新转接一次。

该法保藏时间及效果因微生物种类不同而异。对于某些能同化烃类的微生物效果较差，不宜用。对于酵母菌可每2年移植一次，最长可达6年。保藏某些细菌（例如芽孢杆菌属、醋酸杆菌属），某些丝状真菌（例如青霉属、曲霉属等）效果也很好，可达2～10年不等。有多种细菌和丝状真菌不适合用这种方法保藏，例如固氮菌、乳杆菌、明串珠菌、沙门氏菌、丝枝霉、卷霉、小克银汉霉、毛霉、根霉等属，据报道效果不好。

（2）石蜡覆盖穿刺保藏

穿刺保藏法是斜面保藏法的一种改进，常用于各种好气性细菌的保藏。

①制备穿刺用培养基。配制1%琼脂的半固体培养基装入小试管或螺口小管内，高度为1～2cm。121℃灭菌后，直立使其凝固。

②接种。用接种针在无菌操作条件下挑取菌种少许，朝深层琼脂培养基中央直刺至接近试管底部（切勿穿透到管底），然后沿穿刺线抽出接种针，塞上棉塞。

③培养。将接种过的培养基试管置于适宜温度的恒温培养箱中培养一定时间，直至菌种生长健壮方可取出。

④覆盖液体石蜡。取培养好的半固体培养基，在无菌条件下，倒入已灭菌的液体石蜡，高度超过培养基2～3cm即可，塞上棉塞。

⑤保藏。将加过液体石蜡的半固体培养基放入4℃冰箱中保藏。这种方法适用范围较广，也可用于放线菌和真菌的保藏。

4）注意事项

①液体石蜡易燃，必须防止火灾。

②由液体石蜡封藏的菌体需要移植时，接种针带有石蜡和菌体，遇火焰容易飞溅、爆发，所以要严防污染。

③保藏时应注意定期查看，以免棉塞受潮生霉。若发现培养基露出液面，应及时补充灭菌的液体石蜡。

5）实训结论

将实训结果记录于下表中。

表5.5　菌种生长情况记录表