可以杀灭孢子的灭菌方法

任务2　种曲的制备

种曲是制酱油的种子，在适当的条件下由试管斜面菌种经逐级扩大培养而成，1克种曲中的孢子数达25亿个以上，在制曲时具有很强的繁殖能力。种曲质量的优劣直接影响到成曲质量，如成曲酶活力高低、杂菌数量等，而成曲的好坏又影响到酱油的质量和出品率。所以，种曲的制备也是酱油生产中一个重要环节。

一、制种曲工艺流程

以培养沪酿3．042米曲霉为例，制种曲工艺流程如图2－1所示。

图2－1　种曲制作工艺流程

二、种曲室及其主要设施

种曲室是培养种曲的场所，要求密闭、保温保湿性能好，使种曲有一个既卫生又符合生长繁殖所需要条件的环境。种曲室以小型为宜，一般长4m、宽3．5m、高3m。墙厚度以地区气温情况而定，开有门、窗、天窗各一，室内顶呈弧形，水泥地，有排水沟及保暖设备，种曲室能全部密闭，便于灭菌。周围环境应清洁卫生。

其他设备有：蒸料锅（或蒸料桶），接种混合桶（或盆），振荡筛及扬料机。培养用具有：木盘（45～48）cm×（30～40）cm×5cm，盘底有0．5cm厚的横木条3根。

三、菌种制备

1．菌种的选择

制种曲，首先要选择好优良的菌株。常用的米曲霉菌株有AS3．951（沪酿3．042）、UE336、渝3．811等。从菌种保藏中心购进的菌株，多采用察氏培养基保藏，应用于生产前先用豆汁察氏培养基移接，进行驯化，使其适应生产条件。如不驯化直接用于生产，往往会发生生长慢、孢子数少等现象。

2．纯种三角瓶培养

（1）原料配比

麸皮80g，面粉20g，水80mL。

（2）混合

将上述原料混合均匀，并用筛子将粗粒筛去。

（3）装瓶

一般采用容量为250mL或300mL的三角瓶。将瓶先塞好棉花塞，以150～160℃干热灭菌，然后将料装入，料层厚度以1cm左右为准。

（4）灭菌

蒸汽加压灭菌，0．1MPa，维持30min，灭菌后趁热摇瓶。

（5）接种及培养

待冷却后，在无菌接种橱内接入试管原菌。摇匀后置于30℃恒温箱内，18h左右，三角瓶内曲料已稍发白结饼，摇瓶1次，将结块摇碎，继续置于30℃恒温箱内培养，再过4h左右，有发白结饼，再摇瓶1次。经过2d培养后，把三角瓶轻轻地倒置过来（也可不倒置），继续培养1d，待全部长满黄绿色孢子即可使用。若需放置较长时间，则应置于阴凉处，或置于冰箱中备用。

四、原料要求、配比及处理

1．原料要求

制种曲原料必须适应曲霉菌旺盛繁殖的需要。曲霉菌繁殖时需要大量糖分作为热源，而豆粕含淀粉较少，因此原料配比中豆饼占少量，麸皮占多量，同时还要加入适当的饴糖，以满足曲霉菌的需要。

2．种曲原料的各种配比（水分占原料总量的质量分数）

①麸皮80%，面粉20%，水占前两者90%左右；②麸皮85%，豆饼粉15%，水占前两者70%左右；③麸皮80%，豆饼粉20%，水占前两者100%～110%；④麸皮100%，水占95%左右；⑤麸皮90%，豆粕10%，饴糖5%，水占前三者120%。

3．原料处理方法

豆粕加水浸泡，水温85℃以上，浸泡时间30min以上，搅拌要均匀一致，然后加入麸皮搅拌均匀，入蒸料锅蒸熟达到灭菌的目的并使蛋白质适度变性，出锅后过筛，同时迅速摊开冷却，要求熟料水分为52%～55%，以品温35～40℃接种为宜。

4．灭菌工作

种曲制造必须尽量防止杂菌污染，因此曲室及一切工具在使用前需经洗刷后灭菌。

（1）使用硫黄

每立方米用硫黄25g，放于小铁锅内加热，使硫黄燃烧产生蓝色火焰，即二氧化硫（SO₂）气体。SO₂与水化合产生H2SO₃有灭菌作用，所以采用硫黄灭菌时，要保持曲室及木盒呈潮湿状态。

（2）使用草帘

用清水冲洗干净，蒸汽灭菌1h。

（3）使用甲醛

甲醛对细菌及酵母的杀灭力较强，但对霉菌的杀灭力较弱，甲醛或硫黄两者可混合使用或交替使用效果更佳。

（4）操作人员的手以及不能灭菌的器件

可用75%的酒精擦洗灭菌。

五、接种及培养

1．接种

接种温度为夏天38℃，冬天42℃左右，接种量0．1%～0．5%不等。

2．装盘入室培养

（1）堆积培养

将曲料呈丘形堆积于盘中央，每盘装料（干料计）0．5kg，然后将曲盘以柱形堆叠放于木架上，每堆高度为8个盘，最上层应倒盖空盘一个，以保温保湿。装盘后品温应为30～31℃，保持室温29～31℃（冬季室温32～34℃），干湿球温度计温差1℃，经6h左右，上层品温达35～36℃可倒盘一次，使上下品温均匀，这一阶段为沪酿3．042米曲霉的孢子发芽期。

（2）搓曲、盖湿草帘

继续保温培养约6h，上层品温达36℃左右。由于孢子发芽并生长为菌丝，曲料表面呈微白色，开始结块，这个阶段为菌丝生长期。此时即可搓曲，即用双手将曲料搓碎、摊平，使曲料松散，然后每盘上盖灭菌湿草帘一个，以利于保湿降温，倒盘一次后，将曲盘改为“品”字形堆放。

（3）第二次翻曲

搓曲后继续保温培养6～7h，品温又升至36℃左右，曲料全部长满白色菌丝，结块良好，即可进行第二次翻曲，或根据情况进行划曲，用竹筷将曲料划成长2cm的碎块，使靠近盘底的曲料翻起，利于通风降温，使菌丝孢子生长均匀。翻曲或划曲后仍盖好湿草帘并倒盘，仍以“品”字形堆放。此时室温为25～28℃。干湿球温度计温差为0～1℃，这一阶段菌丝发育旺盛，大量生长蔓延，曲料结块，称为菌丝蔓延期。

（4）洒水、保湿、保温

划曲后，地面应经常洒冷水保持室内湿度，降低室温，使品温保持在34～36℃，干湿球温度计温差达到平衡，相对湿度为100%，这期间每隔6～7h应倒盘一次。这个阶段已经长好的菌丝又长出孢子，称为孢子生长期。

（5）去草帘

自盖草帘后48h左右，将草帘去掉，这时品温趋于缓和，应停止向地面洒水，并开天窗排潮，保持室温（30±1）℃，品温35～36℃，中间倒盘一次，至种曲成熟为止。这一阶段孢子大量生长并老熟，称为孢子成熟期。

自装盘入室至种曲成熟，整个培养时间共计72h。在种曲制造过程中，应每1～2h记录一次品温、室温及操作情况。

六、种曲质量指标

1．感官特性

外观：菌丝整齐健壮，孢子丛生，呈新鲜黄绿色并有光泽，无夹心，无杂菌，无异色；香气：具有种曲固有的曲香，无霉味、酸味、臭味等不良气味；手感：用手指触及种曲，松软而光滑，孢子飞扬。

2．理化指标

孢子数：用血球计数板法测定米曲霉种曲，孢子数应在6×10⁹个／g（以干基计）以上；孢子发芽率：用悬滴培养法测定发芽率，要求达到90%以上；细菌数：米曲霉种曲细菌数不超过10⁷个／g；蛋白酶活力：新制曲在5000单位以上，保存制曲在4000单位以上；水分：新制曲水分35%～40%，保存制曲水分10%以下。