维生素的生产

任务1　维生素B₂的生产

一、维生素B₂的概述

1．维生素B₂的结构

维生素B₂又称核黄素，在自然界中多与蛋白质相结合而被称作核黄素蛋白。维生素B₂是由异咯嗪环与核糖构成的，结构式如下：

维生素B₂（核黄素）

2．维生素B₂的理化性质

维生素B₂为黄色或橙黄色结晶性粉末，味微苦，熔点约为280℃，是两性化合物，在酸性溶液中稳定，在碱性溶液中不稳定，易被热、光破坏，极微溶于水，几乎不溶于乙醇和氯仿，不溶于丙酮、乙醚。其水溶液呈黄绿色荧光，在波长565nm、pH4～8之间荧光最强。

3．维生素B₂的生理功能

维生素B₂分子的异咯嗪环中第1位和第10位两氮原子可被还原，在生物代谢过程中有递氢的作用，它与机体内的ATP作用生成黄素单核苷酸（FMN），FMN再与ATP作用，就生成黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD），两者是多种脱氢酶的辅酶，是重要的递氢体，可促进生物氧化作用。因此，维生素B₂是动物发育和许多微生物生长的必需因子。人和动物体缺乏维生素B₂时，细胞呼吸减弱，代谢强度降低，主要症状为唇炎、舌炎、口角炎、眼角膜炎、皮炎等，所以维生素B₂还是治疗眼角膜炎、白内障、结膜炎等的主要药物之一。

4．维生素B₂的生产方法

维生素B₂的分布很广，青菜、黄豆、动物肝脏、肾、心、乳中含量较多，酵母中的含量也很丰富。核黄素虽然广泛存在于动、植物中，但因含量很低，不适宜采用从天然产物中提取的方法制备维生素B₂的原料。而化学合成法步骤多，成本比微生物发酵法高，所以目前工业上维生素B₂的生产主要采用微生物发酵法，工艺路线如图5－6所示。

图5－6　维生素B₂发酵生产的工艺路线

二、生产菌种的选育

许多微生物可以产生维生素B₂，如棉病囊霉、阿氏假囊酵母、酵母、假囊酵母、根霉、曲霉、青霉、梭状芽孢杆菌、产气杆菌、大肠杆菌和枯草芽孢杆菌等，但真正能用于工业化生产的微生物种类不多。工业上使用的维生素B₂产生菌主要有阿氏假囊酵母和棉病囊霉。经过菌种改良后，维生素B₂生产的最高水平可达到7000～10000U／mL，且产品质量好，成本低。

1990年德国的BASF公司首先使用棉病囊霉作为生产菌株进行核黄素的商业化生产。经过6年的发展，他们最终用微生物发酵法完全取代了化学合成法。

随着分子生物学的发展，基因工程等先进技术已应用于核黄素生产菌种的育种中。2000年瑞士的Roche公司采用了基因工程菌种枯草芽孢杆菌用于维生素B₂的生产，该菌种具有产量高、能耗低等优点，经济效益十分显著。我国的广济药业公司是国内最大的维生素B₂生产厂，从国外引进了维生素B₂的高产菌株——枯草芽孢杆菌基因工程菌株，发酵水平可达17000～20000U／mL。目前工业生产中常用的核黄素生产菌种见表5－3。

表5－3　核黄素工业生产中的常用菌种

三、培养基成分的选择

1．孢子斜面培养基

葡萄糖2g，蛋白胨0．1g，麦芽浸膏5g，琼脂2g，水100mL，调pH6．5。

2．发酵培养基

发酵培养基中以植物油、葡萄糖、糖蜜或大米粉等作为主要碳源，植物油中以豆油对维生素B₂产量提高的效果最为显著，有机氮源以蛋白胨、骨胶、鱼粉、玉米浆为主，无机盐有NaCl、K₂HPO₄、MgSO₄。

如果采用少量的葡萄糖和一定数量的油脂作为混合碳源时，维生素B₂的产量可增加4倍。这可能是微生物在油脂的缓慢作用下，解除了葡萄糖或其代谢产物对维生素B₂生物合成的阻遏作用。在研究烷烃类化合物作碳源时，发现此时菌体合成的维生素B₂易分泌到细胞外，这可能是烷烃类物质影响细胞膜和细胞壁结构的缘故。各种油脂与核黄素发酵单位间的关系如表5－4所示。

表5－4　各种油脂与维生素B₂发酵单位间的关系

培养基中常用的氮源有蛋白胨、鱼粉、骨胶等有机氮源。其中蛋白胨的品种和质量对维生素B₂的产量有显著影响，见表5－5。

表5－5　蛋白胨的品种对棉病囊霉合成核黄素的影响

常用发酵培养基配方：米糠油4g，玉米浆1．5g，骨胶1．8g，鱼粉1．5g，KH₂PO₄ 0．1g，NaCl 0．2g，CaCl₂0．1g，（NH₄）₂SO₄0．02g，水100mL。

3．前体及刺激剂

嘌呤类化合物作为前体对维生素B₂的生物合成有促进作用。此外，肌醇、甲硫氨酸等对维生素B₂的生物合成有刺激作用，见表5－6。

将肌醇与葡萄糖结合起来，并采取半连续滴加的方式培养，可明显提高发酵单位。

表5－6　嘌呤类化合物对维生素B₂生物合成的影响

四、菌种的培养及发酵

生产上多采用二级种子、三级发酵。将阿氏假囊酵母接种于孢子斜面培养基上，于25℃培养9d，然后用无菌水制成孢子悬浮液，接种到种子培养基中，于30℃培养30～40h，种子扩大培养和发酵的通气量要求均比较高，通气量一般为1∶1，罐压为0．05 MPa左右，搅拌功率要求比较高。将上述种子液接种到二级种子罐中，于30℃培养20 h，按2%～3%的接种量将二级种子液接种到发酵罐中，发酵培养40h后开始连续流加补糖，发酵液的pH控制在5．4～6．2，温度为30℃，发酵周期为150～160h。

通气效率高低是影响维生素B₂产量的关键，通气效果好，可促进大量膨大菌体的形成，维生素B₂的产量迅速上升，同时可缩短发酵周期。因此，大量膨大菌体的出现是产量提高的生理指标。如在发酵后期补加一定量的油脂，能使菌体再生，形成第二膨大菌体，可进一步提高产量。

五、发酵液的预处理及固－液分离

发酵结束后，向发酵液中加入2mol／L的HCl调pH为5～5．5，以释放部分与蛋白质结合的维生素B₂，再加适量黄血盐和硫酸锌，然后加入维生素B₂1．4倍量的3－羟基－2－萘甲酸钠，并于70～80℃加热10min，滤除沉淀。

六、提取与精制

将上述滤液用2mol／L的HCl调pH为2～2．5，于5℃下静置8～12h，将下层悬浮物压滤得3－羟基－2－萘甲酸钠维生素B₂沉淀，再用等量浓HCl酸化，经离心分离得上清液为维生素B₂溶液，沉淀为3－羟基－2－萘甲酸钠（可循环使用）。再向上溶液中加一定量的NH₄NO₃，于60～70℃加热氧化20min，得维生素B₂氧化物，再加5倍体积的蒸馏水及维生素B₂晶种，搅匀，5℃结晶过夜，得维生素B₂粗品。将粗品用适量蒸馏水溶解，加1mol／L的NaOH溶液调pH为5～6，滤去沉淀，向滤液中加适量品种煮沸，结晶过夜，次日滤取结晶，用酸水洗两次，抽干，并于60℃烘干，过80目筛得维生素B₂成品。