任务2 维生素C的生产
一、维生素C的概述
1．维生素C的结构
维生素C又称抗坏血酸，化学名称是L－2，3，5，6－四羟基－2－己烯酸－γ－内酯，分子式为C6H8O6，相对分子质量为176．12。维生素C为酸性己糖衍生物，是烯醇式己糖酸内酯。其分子结构有L型和D型2种异构体，只有L型有生理功能。化学结构如下：
2．维生素C的理化性质
维生素C是无色、无臭的片状结晶体，味酸，熔点为190～192℃，易溶于水，略溶于乙醇，不溶于乙醚、氯仿及石油醚等。由于分子中含有二烯醇基，所以具有很强的还原性，易被光、热、空气氧化成脱氢抗坏血酸。微量金属离子可加速其氧化，同时还可促使内酯环水解，进一步发生脱羧反应生成糠醛，这是维生素C在储存中变色的主要原因。因此维生素C要求在密封、干燥、避光及低温下保存。维生素C在酸性溶液中稳定；在水溶液中，还原型维生素C的烯醇式羟基的氢可解离成H＋，使水溶液呈酸性。
3．维生素C的生理功能
由于维生素C具有还原性，在体内可以参与氧化还原反应，是一些氧化还原酶的辅酶，具有抗氧化、抗衰老、防癌的作用，还可用于重金属盐的解毒及作为供氢体使用。维生素C能使组织产生胶原质，影响毛细血管的通透性及血浆的凝固，刺激造血功能，促使血脂下降，增强人体的免疫功能，增加机体的抵抗力。缺乏维生素C易患坏血病，但长期过量服用则易引起中毒，导致呕吐、麻疹、腹绞痛、尿结石等。
维生素C广泛存在于新鲜水果及绿叶蔬菜中，尤以番茄、橘子、鲜枣、山楂、刺梨及辣椒等含量丰富。中草药如醋柳果、苍耳子等也富含维生素C。松针含维生素C极为丰富。植物中含有抗坏血酸氧化酶，能催化维生素C氧化。人类、灵长类和豚鼠体内缺乏合成维生素C的酶类，因此不能自身合成，必须依靠食物供给。
4．维生素C的生产方法
维生素C的生产方法大致可分为3类，即化学合成法、化学合成结合生物合成法（也称为半合成法）和生物合成（发酵）法。1933年，Reichstein和Ault领导的两个研究小组分别提出了维生素C化学合成的方法，但由于合成路线长、收率低，并没有实现工业化生产。因此维生素C的生产仍以半合成法和生物合成法为主。
1）半合成法
（1）莱氏法
从1937年起，以Reichstein和Grussner的发明为基础，建立了从葡萄糖出发，用化学法结合发酵法生产维生素C的“莱氏法”，从此维生素C进入了大规模工业化生产阶段。这一方法后经不断改进和完善，在世界上得以广泛应用。莱氏法工业生产的总收率达60%以上。由于葡萄糖原料便宜且易得，中间化合物尤其是双丙酮－L－山梨糖的化学性质稳定，工艺流程不断改进及产品质量好等原因，采用莱氏法生产维生素C曾是世界几大制药公司采用的生产方法。
（2）两步发酵法
20世纪60年代以来，各国科学家一直探索更好的维生素C生产方法，相继提出了许多反应路线，并在此基础上对有关反应的工艺路线进行了改进，但真正成功地应用于生产实践的还是我国发明的两步发酵法。两步发酵法是采用不同的微生物进行两步微生物转化，将D－山梨醇直接转化为2－酮基－L－古龙酸。此法使产品产量得到大幅度提高。
2）生物合成法
2－酮基－L－古龙酸是合成维生素C的直接前体，研究葡萄糖转化成2－酮基－L－古龙酸的生物转化机制，不仅对现实生产中的菌种选育和发酵条件控制有指导作用，而且对研究一步发酵法生产维生素C具有理论指导意义。
二、生产菌种的选育
能催化D－山梨醇转化为L－山梨糖的菌种主要有：生黑醋酸杆菌、生黑葡萄糖酸杆菌和弱氧化醋酸杆菌。
能催化L－山梨糖转化为2－酮基－L－古龙酸的菌种为氧化葡萄糖酸杆菌（小菌），但由于小菌单独存活的能力很弱，需要和另外一种菌——巨大芽孢杆菌混合培养时才能够生存并产生2－酮基－L－古龙酸。此外，假单胞菌也能催化L－山梨糖直接氧化为2－酮基－L－古龙酸。
三、菌种的培养及发酵
1．第一步发酵
弱氧化醋酸杆菌经种子扩大培养，接入发酵罐，种子和发酵培养基主要包括山梨醇、玉米浆、酵母膏、碳酸钙等成分，pH为5．0～5．2。山梨醇浓度控制在24%～27%，培养温度为29～30℃。发酵结束后，发酵液经低温灭菌，移入第二步发酵罐做原料。D－山梨醇转化为L－山梨糖的生物转化率达98%以上。
2．第二步发酵
氧化葡萄糖酸杆菌和巨大芽孢杆菌混合培养。种子和发酵培养基的成分相似，主要有L－山梨糖、玉米浆、尿素、碳酸钙、磷酸二氢钾等，pH为7．0。大、小菌经二级种子扩大培养，接入含有第一步发酵液的发酵罐中。发酵罐采用气升式搅拌，29～30℃下通入大量无菌空气搅拌，培养72h左右结束发酵，由L－山梨糖生成2－酮基－L－古龙酸的转化率可达70%～85%。
四、2－酮基－L－古龙酸的分离提纯
经两步发酵后，发酵液中含有8%左右的2－酮基－L－古龙酸，同时含有菌体、蛋白质和悬浮的固体颗粒等杂质，常采用加热沉淀法、化学凝聚法、超滤法分离提纯。分离纯化工艺流程如图5－7所示。
图5－7 2－酮基－L－古龙酸的分离提纯工艺流程
五、2－酮基－L－古龙酸的化学转化
常采用碱转化法将维生素C前体2－酮基－L－古龙酸转化为维生素C。2－酮基－L－古龙酸在甲醇中用浓硫酸催化酯化生成2－酮基－L－古龙酸甲酯，加NaHCO3转化生成维生素C钠盐，经氢型离子交换树脂酸化得到维生素C。
六、维生素C的精制
维生素C的精制工艺流程如图5－8所示。
图5－8 维生素C的精制工艺流程
注意的问题：由于维生素C不稳定，在精制的溶解和脱色过程中应控制温度和时间，压滤过程中避免析出结晶；在浓缩和真空干燥时，必须保持较高的真空度以维持较低的温度。
维生素C的两步发酵法虽有很多优点，但其分离纯化工艺较繁杂，周期长，收率低。现可采用弱碱性离子交换树脂从发酵液中直接提取2－酮基－L－古龙酸，用甲醇－硫酸溶液洗脱，省去浓缩结晶步骤，洗脱收率可达96%。还可将发酵液通过超滤膜，使2－酮基－L－古龙酸钠与蛋白质等大分子分离，简化了提取工艺，其提取工艺流程如图5－9所示。
图5－9 维生素C的提取工艺流程
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