鉴定与育种

任务1　纤维素酶产生菌的分离筛选、鉴定与育种

自然界中的细菌、放线菌、真菌等都能产生纤维素酶。细菌产生的纤维素酶的量较低，主要是EG，少数细菌能分泌外切葡聚糖酶，大多数细菌EG对结晶纤维素没有活性，而且这些酶主要是胞内酶，吸附于细胞壁上，很少能分泌到细胞外，增加了提纯的难度，在工业上很少应用。目前研究较多的是纤维素粘菌属、生孢纤维粘菌属、纤维杆属和芽孢杆菌属。放线菌中主要是黑红旋丝放线菌、玫瑰色放线菌和纤维放线菌能产生纤维素酶，但产量不高。酵母菌不产纤维素酶，但可以利用酵母表达系统表达纤维素酶基因，其产物高度糖基化，经正确加工修饰后可直接分泌到培养基中，表达水平高。目前用于生产纤维素酶的微生物大多属于真菌，研究较多的有木霉属、曲霉属和青霉属。

一、产纤维素酶真菌的分离筛选

产纤维素酶真菌多存在于富含纤维素的菜地、腐烂的树根及朽木周围的土壤，以及能分解纤维素的反刍动物的粪便中，其分离原理和方法大致如下：将土样或粪样用无菌水悬浮，取少量上清液到PDA培养基中，30℃振荡培养3～5d；将培养液进行梯度稀释，选取合适浓度的稀释液涂布在含有羟甲基纤维素（CMC）为唯一碳源的培养基上，30℃倒置培养，根据有无透明圈定性分离纤维素酶产生菌（大多为真菌）；将能产生透明圈的待测菌涂布在刚果红鉴别培养基上，培养后精确测量菌落直径和透明圈直径；最后，选取透明圈与菌落直径比值（D／d）较大的菌落，用斜面培养基保藏，以备后用。

对于不同的实验室，采用的分离方法大同小异，差别主要在于培养基的使用。同时也可使用滤纸限制性培养基来鉴定产纤维素酶真菌。

二、产纤维素酶真菌的鉴定

根据《真菌鉴定手册》进行。

1．形态鉴定

1）方法

菌落形态观察：将菌株点植一点于PDA平板中央，30℃培养48h，观察其宏观形态特征。

显微观察：用PDA培养基埋片培养，30℃培养2d后取埋片，光学显微镜观察其微观形态特征。

2）结果

一般真菌的菌落个体较大，形状多为绒毛状、絮状、蛛网状，多产色素，但颜色多不唯一（孢子的颜色）。而对于不同种属的真菌，又有各自的独特菌落、菌丝或孢子形态及生长特性，具体根据《真菌鉴定手册》进行鉴定。

2．18SrDNA分子鉴定

根据《分子克隆手册》，提取待测菌株基因组DNA，采用真菌18SrRNA基因的通用引物，克隆待测菌株的18SrDNA基因片段，并测序。根据测序结果，利用Blast软件从GenBank数据库中搜索相关放线菌菌株的18SrRNA基因序列，随后运用Mega软件的Clustal W功能进行多序列比对分析，按照Neighbor－joining法构建系统进化树，运用DNAMAN软件进行序列同源性比较分析。同源性要求超过98%。

三、产纤维素酶真菌的育种

通常自然界分离筛选的野生型菌株其产酶能力相对较低。选育优良菌种是提高纤维素酶活力的关键，纤维素酶高产菌株的筛选方法主要有诱变筛选和基因工程筛选方法。

1．诱变育种

诱变育种又分为单一诱变和复合诱变。诱变剂主要有紫外线、微波、硫酸二乙酯、氯化锂、亚硝基胍等种类。

紫外线诱变：用生理盐水制备10⁵～10⁶个／mL的孢子悬液，取孢子悬液10mL于半径为9cm的培养皿中，在磁力搅拌下距离30W紫外灯15cm照射3～5min。适当稀释孢子悬液，涂布于筛选平板，30℃培养3～4d，根据上述方法进行初筛。

亚硝基胍（NTG）诱变：用生理盐水配成10⁵～10⁶个／mL孢子悬液，一定浓度NTG（0．1mol／L），30℃，pH为8．0的Tris缓冲体系作用0．5～1．5h，离心洗涤孢子，终止诱变，适当稀释孢子悬液，涂布于筛选平板，30℃培养3～4d，根据上述方法进行初筛。

紫外线和亚硝基胍复合诱变：先用一定浓度的NTG（用Tris－HCl缓冲液调pH至7．0），处理0．5～1．5h，离心，用生理盐水洗涤，终止诱变，然后用生理盐水制成孢子悬液，紫外照射4min。适当稀释孢子悬液，采用上述方法进行初筛。

突变株的遗传稳定性试验：将筛选得到的突变株在培养基斜面上进行多次传代试验培养，每转接1次的同时接入发酵培养基进行培养产酶试验，成熟后测其酶活性，并观察孢子布满整个斜面的时间、孢子大小、颜色等指标是否保持不变。

2．基因工程育种

目前，利用基因工程技术将纤维素酶基因克隆到细菌、酵母中取得了一定进展。其方法目前也已经很成熟，如唐婧（2008）从花的腐败残余物中分离到一株β－葡萄糖苷酶高产菌株，提取该菌株的全基因组DNA后，以大肠杆菌为表达宿主菌，通过鸟枪法构建全基因组文库，从该菌株的基因组中克隆到一个含有1230bp、编码409个氨基酸的新的β－葡萄糖苷酶基因nglu02。HCA位点同源性分析及系统发育树分析表明，该基因属于纤维素酶Ⅰ家族。Ni J等（2007）对来自白蚁的4个内切葡聚糖酶基因进行了家族DNA改组以获得热稳定性高的突变酶，所得PA68突变体酶的热稳定性提高了10℃，其羟甲基纤维素（CMC）酶比活力达到其中一个亲本酶rRsEG的13．1倍。