纤维素酶产生菌培养条件的优化

任务3　纤维素酶产生菌培养条件的优化

一、影响菌株产生纤维素酶的培养条件

微生物的生长和代谢产物的积累既受到菌种本身的影响，也受到营养和环境条件的影响，其生物合成途径、产物种类及其性质、产量及产率与碳源、氮源、无机盐、pH、温度、接种量和通气状况等多种因素有密切关系。

1．碳源对菌株产酶的影响

纤维素酶是诱导酶，在微生物发酵过程中，作为碳源的纤维素同时也是诱导物的主要来源。不同的纤维素被微生物利用的难易程度不同，对纤维素酶的诱导作用也不同，因为起诱导作用的不是纤维素本身，而是纤维素的分解产物。现在认为纤维素酶的诱导机理是：胞外的纤维素被微量的组成型纤维素酶分解成纤维寡糖，纤维寡糖进入细胞，并作为继续合成大量诱导型纤维素酶的诱导物，促进纤维素酶的合成。

碳源的分解产物有的作为诱导物，也有的作为阻遏物。分解产物浓度的不同，可能起的作用也不同。例如，纤维二糖在低浓度时是纤维素酶的诱导物，而在高浓度就成了产酶抑制剂。因此，不同的纤维素质碳源对微生物产酶影响很大。

对于纤维素酶产生菌的碳源主要有CMC－Na、锯渣、稻草粉、黄豆粉、麸皮和纤维素粉，当然也包括葡萄糖、淀粉等普通碳源。不同来源的菌株最适的碳源不同，有的以单碳源为佳，有的以两种碳源的组合为好，组合碳源多以麸皮和另外一种碳源组合为多，比如CMC－Na和麸皮、稻草和麸皮，因为麸皮不仅仅是碳源，还含有较丰富的营养因子，能促进微生物的生长。

另外还需要注意，碳源的浓度合适与否也会影响纤维素酶的产生，如果是组合碳源也要注意两种碳源之间的比例。有研究表明，组合碳源中麸皮含量的变化相比于稻草粉会改变培养基的蓬松程度，使通气量提高或降低，影响纤维素酶的产生。

2．氮源对菌株产酶的影响

在无氮基础培养基中添加相同浓度的不同氮源（蛋白胨、酵母提取物、牛肉膏、硫酸铵、NH₄Cl、磷酸二氢铵、尿素、黄豆粉等），以一定的接种量接种培养3～5d，分别测定其EG、FPase、CBH酶活力，考察氮源对产酶的影响。

据相关研究结果，不同氮源对产酶有较大影响，且单一替代氮源不如复合氮源效果好。对于单一氮源，无机氮要优于有机氮，铵态氮优于硝态氮，其中硫酸铵效果最好，因为硫酸铵在纤维素酶产生菌的前期代谢中具有很好的利用率和适应性，因此硫酸铵多用作大规模纤维素酶发酵生产的优良氮源。对于复合氮源，鉴于硫酸铵的优良效果，多采用硫酸铵和其他氮源，如蛋白胨、尿素等的组合。

还需要说明的是，不同的氮源对EG、FPase、CBH酶三种酶活力的影响不尽相同，因此对于不同来源的纤维素酶产生菌，其氮源的确定要综合各种因素。

3．微量元素对菌株产酶的影响

在酶制剂的生产过程中，不但目的酶的活性的展示需要微量元素的存在，而且催化目的酶产生的酶的作用也需要有微量元素的存在（作为辅酶因子）。而不同酶需求的微量元素不同，因此在培养基中可以选择性地加入一些微量元素，对产酶会有一定的促进作用。对于纤维素酶的产生，Mn^2＋和Mg^2＋的作用多为促进，而Cu^2＋和Fe^3＋对产酶有明显的抑制作用。

4．培养温度对菌株产酶的影响

温度是影响细胞生长和发酵产酶的重要因素之一。随着温度的提高，反应速度加快，即酶活力提高。但温度升至太高会使酶变性增加，活性酶的量降低，因此，细胞生长和发酵产酶均存在着一个最佳温度。对于产纤维素酶的细菌，其培养温度多在37℃左右，而对于真菌多为25～30℃。另外，有部分产纤维素酶菌其细胞生长温度与产酶温度不同，因此在实际的发酵过程中需要在不同阶段采用不同的温度。

5．培养基初始pH对菌株产酶的影响

对于液态发酵，初始pH过低，纤维素质原料不能充分糖化，致使底物缺乏，产酶能力降低。当pH过高时，易使菌体过早老化、自溶，产酶周期缩短，且酶较易失活。对于产纤维素酶的细菌，其培养基初始pH为7～8，而对于真菌多为4．5～5．5。

6．其他因素对菌株产酶的影响

除了上述的因素之外，发酵时间、装液量、接种量对菌株产酶也有一定的影响。而对于固态发酵来讲，除了要控制好上述条件，还要注意料水比，即固液比，还有通气量等因素的影响。对于不同的纤维素酶产生菌，这些因素的变化范围较大，所用标准也不统一，因此需要根据实际情况进行优化确定。

二、优化纤维素酶产生菌培养条件的方法

如何快速地找出主要因素并进行优化并非易事。通常优化发酵培养基的方法为单次单因子法、正交试验设计法以及响应面分析法。

1．单次单因子法

单次单因子法的基本原理是保持培养基中其他组分的浓度不变，每次只研究一个组分的不同水平对发酵性能的影响。该方法的优点是简单、容易，结果很明了，培养基组分的个体效应从图表上很明显地看出来，而不需要统计分析。主要缺点：忽略了组分间的交互作用，可能会完全丢失最适宜的条件；不能考察因素的主次关系；当考察的试验因素较多时，需要大量的试验和较长的试验周期。但由于它的容易和方便，单次单因子法一直以来都是培养基组分优化的最流行的选择之一。

对于纤维素酶的产生条件的优化，单次单因子法主要用于重要的碳、氮源的优化，为后期的正交试验设计法、响应面分析法提供基础。

2．正交试验设计法

正交设计是从“均匀分散、整齐可比”的角度出发，以拉丁方理论和群论为基础，用正交表来安排少量的试验，从多个因素中分析出哪些是主要的，哪些是次要的，以及它们对试验的影响规律，从而找出较优的工艺条件。李荣杰（2009）利用正交试验设计法优化了里氏木霉的培养条件，使其产纤维素酶活力达到15．6U／mL，比出发菌株提高了1倍。朱振（2009）利用该法优化了真菌RCEF4093的发酵培养基，提高了其产纤维素酶的活力。该方法大致流程如下。

（1）明确试验目的，确定评价指标

评价指标有时只有一个，有时可能有多个。当评价指标多于两个时，为多指标试验。

（2）挑选因素

影响试验指标的因素很多，由于试验条件的限制，不可能逐一或全面地加以研究，因此要根据已有的专业知识及有关文献资料和实际情况，固定一些因素于最佳水平，排除一些次要的因素而挑选一些主要因素。正交试验设计法正是安排多因素试验的有利工具。当因素较多时，除非事先根据专业知识或经验等，能肯定某因素作用很小而不选取外，对于凡是可能起作用或情况不明或看法不一的因素，都应当选入进行考察。

（3）确定各因素的水平

因素的水平分为定性与定量两种，水平的确定包含两个含义，即水平个数的确定和各个水平数量的确定。对于定性因素，要根据试验具体内容，赋予该因素每个水平以具体含义。定量因素的量大多是连续变化的，这就要求试验者根据相关知识或经验、文献资料首先确定该因素的数量变化范围，之后根据试验的目的及性质，结合正交表的选用来确定因素的水平数和各水平的取值。每个因素的水平数可以相等也可以不等，重要因素或特别希望详细了解的因素，其水平可多一些，其他因素的水平可以少一些。如果没有特别重要的因素需要详细考察的话，要尽可能使因素的水平数相等，以便减小试验数据处理工作量。

（4）制定因素水平表

根据上面选取的因素及因素的水平的取值，制定一张反映试验所要考察研究的因素及各因素的水平的“因素水平综合表”。该表在制定过程中，每个因素用哪个水平号码，对应于哪个量可以随机地任意确定。最好是打乱次序安排，但一经选定之后，试验过程中就不能再改变了。

（5）选择合适的正交表

常用的正交表较多，有几十个，可以灵活选择。应该注意的是，选择正交表与选择因素及其水平是相互影响的，必须综合考虑，而不能将任何一个问题孤立出来。选择正交表时一般需考虑以下两个方面的情况。

①所考察因素及其水平的多少。

选用的正交表，要能容纳所研究的因素数和因素的水平数，在这一前提下应选择试验次数最少的正交表。

②考虑各因素之间的交互作用。

一般说来，两因素的交互作用通常都有可能存在，而三因素的交互作用在通常情况下可以忽略不计。

（6）确定试验方案

根据制定的因素水平表和选定的正交表安排试验时，一般原则如下。

①如果各因素之间无交互作用，按照因素水平表中固定下来的因素次序，顺序地放到正交表的纵列上，每一列放一种因素。

②如果不能排除因素之间的交互作用，则应避免将因素的主效应安排在正交表的交互效应列内，以妨碍对因素主效应的判断。

③把各因素的水平按照因素水平表中所确定的关系，对号入座后，试验方案随即确定。

（7）正交试验结果的分析

正交试验结果的直观分析与正交试验结果的方差分析相比，具有计算量小、计算简单、分析速度快、一目了然等特点，但分析结果的精确性与严密性相对于方差分析来说稍差。直观分析主要可以解决以下两个问题。

①各因素对指标的影响谁主谁次。

极差的大小直接反映各个因素对试验指标影响的变化幅度，极差大表明该因素的影响大，是主要因素；反之，极差小，表明该因素的作用不大，属于次级因素。因此，可以通过比较各个因素的极差大小决定因素的主次顺序。但因素影响的显著性需通过方差分析确定。

②求最佳水平组合。

该问题归结为找到各因素分别取何水平时，所得到的试验结果会最好。选取因素的水平是与要求的指标有关的。如要求的指标越大越好，应该取使指标增大的水平；反之，如要求的指标越小越好，则取其中最小的那个水平。把各因素的好水平组合起来就是最佳水平组合。但是，实际上选取最佳水平组合时，还要考虑因素的主次，以便在同样满足指标要求的情况下，对于一些比较次要的因素按照优质、高产、低消耗的原则选取水平，得到更符合生产实际要求的较好的生产条件。

3．响应面分析法

正交试验设计法不能在给出的整个区域上找到因素和响应值之间的一个明确的函数表达式，即回归方程，从而无法找到整个区域上因素的最佳组合和响应值的最优值。而且对于多因素多水平试验，仍需要做大量的试验，实施起来比较困难。响应面分析方法则能研究几种因素间的交互作用，试验次数少、周期短，求得的回归方程精度高，并能够通过求得的方程获得试验区域内各因素的最优组合。郝学财（2006）利用响应面分析法对影响里氏木霉高产变异株WX－112产纤维素酶的发酵培养基主要因素进行了筛选和优化，得出液态深层发酵产纤维素酶的最佳培养基，并进一步优化了发酵培养条件，使产酶能力比初始条件提高了3倍。冯培勇等（2009）利用响应面分析法对黑曲霉产纤维素酶的发酵条件进行了优化，使酶活力达360．02U／mL，较初始发酵条件提高了34．4%。