纤维素酶的液态发酵生产

技能训练2　纤维素酶的液态发酵生产

一、能力目标

①能根据老师的讲述，复述纤维素酶的液态发酵生产流程。

②能参考相关文献，设计并完成纤维素酶的液态发酵生产流程。

二、生产工艺流程

纤维素酶液态发酵法工艺流程如图6－7所示。

图6－7　纤维素酶液态发酵法工艺流程

三、实训材料

1．菌株

黑曲霉菌种。

2．培养基配方

平板培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，MgSO₄·7H₂O 5g，K₂HPO₄1．5g，pH自然，琼脂粉8g。

种子培养基同平板培养基，但不加琼脂粉。

发酵培养基：纤维素粉30g，KNO₃30g，聚乙二醇1g，初始pH6．5，250mL三角瓶装25mL液体培养基。

3．纤维素酶活力测定主要试剂及其配制

（1）浓度为1mg／mL的葡萄糖标准液

葡萄糖在恒温干燥箱中90℃条件下干燥至恒重，准确称取100mg于150mL小烧杯中，用少量蒸馏水溶解，移入100mL容量瓶中用蒸馏水定容至100mL，充分混匀。4℃冰箱中保存（可用12～15d）。

（2）3，5－二硝基水杨酸（DNS）溶液

准确称取DNS 6．3g于500mL烧杯中，用少量蒸馏水溶解后加入2mol／L NaOH溶液262mL，再加到500mL含有185g酒石酸钾钠（C₄H₄O₆KNa·4H₂O，相对分子质量为282．22）的热水溶液中，再加结晶酚（C₆H₅OH，相对分子质量为94．11）5g和无水亚硫酸钠（Na₂SO₃，相对分子质量为126．04）5g，搅拌溶解，冷却后移入1000mL容量瓶中用蒸馏水定容至1000mL，充分混匀。储于棕色瓶中，室温放置一周后使用。

（3）0．05mol／L pH4．5的柠檬酸缓冲液

A液（0．1mol／L柠檬酸溶液）：准确称取C₆H₈O₇·H₂O（相对分子质量为210．14）21．014g于500mL烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，移入1000mL容量瓶中用蒸馏水定容至1000mL，充分混匀。4℃冰箱中保存备用。

B液（0．1mol／L柠檬酸钠溶液）：准确称取Na₃C₆H₅O₇·2H₂O（相对分子质量为294．12）29．412g于500mL烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，移入1000mL容量瓶中，然后用蒸馏水定容至1000mL，充分混匀。4℃冰箱中保存备用。

取上述A液27．12mL，B液22．88mL，充分混匀后移入100mL容量瓶中用蒸馏水定容至100mL，充分混匀，即为0．05mol／L pH4．5的柠檬酸缓冲液。4℃冰箱中保存备用，用于测定滤纸酶活力。

（4）0．05mol／L pH5．0的柠檬酸缓冲液

取上述A液20．5mL，B液29．5mL，充分混匀后移入1000mL容量瓶中用蒸馏水定容至100mL，充分混匀，即为0．05mol／L pH5．0的柠檬酸缓冲液。4℃冰箱中保存备用，用于测定C₁酶活力。

（5）0．51%羟甲基纤维素钠（CMC－Na）溶液

精确称取CMC－Na 0．51g于100mL烧杯中，加入适量0．05mol／L pH5．0的柠檬酸缓冲液，然后移入100mL容量瓶中并用0．05mol／L pH5．0的柠檬酸缓冲液定容至100mL，用前充分摇匀。4℃冰箱中保存备用，用于测定C_x酶活力。

（6）0．5%水杨酸苷溶液

准确称取水杨酸苷0．5g于100mL烧杯中，用少量0．05mol／L pH4．5的柠檬酸缓冲液溶解后，移入100mL容量瓶中并用0．05mol／L pH4．5的柠檬酸缓冲液定容至100 mL，充分混匀。4℃冰箱中保存备用，用于测定β－葡萄糖苷酶活力。

4．主要仪器与设备

电热恒温培养箱、净化工作台、紫外可见分光光度计、电子分析天平、水浴振荡器、电热恒温鼓风干燥箱、低速台式大容量离心机、pH测试仪、真空干燥箱等。

四、操作要点

（一）摇瓶培养

1．种子制备

取保存于4℃冰箱的纤维素酶产生菌种（绿色木霉或里氏木霉）移植于斜面培养基上32℃培养4～6d，以长满黑色孢子为准。

在250mL三角瓶中装入30mL种子培养基，接入一环斜面菌种，32℃，150r／min旋转摇床培养24h供作种子。

2．摇瓶培养

在250mL三角瓶中装入25mL发酵培养基，接种量为10%（体积比），32℃、150 r／min旋转摇床培养5d。

（二）发酵罐培养

1．发酵前处理

10L发酵罐装入6L发酵培养基，灭菌。按照10%接种量接种二级种子（在摇瓶培养种子制备基础上再扩大培养一次）。

2．培养条件

温度为30～32℃，通气比为1∶（0．7～1），搅拌速度为250～400r／min，溶解氧饱和度控制在30%。通过加入2mol／L的氨水来自动控制发酵液的pH为4．0，若pH下降速度变慢，可适当加入一定量的木质纤维。当发酵液pH不再下降或回升，且发酵液黏稠度明显降低时可作为终止发酵的根据。

（三）纤维素酶液制备

取培养液于4000r／min离心20min，除去菌体及培养基，上清液再用抽滤瓶减压过滤，滤液即为粗酶液。取粗酶液1mL，加0．05mol／L柠檬酸缓冲液至10mL，即为稀释10倍的原酶液，可用来测定酶活力。

（四）葡萄糖标准曲线的制作

绘制标准曲线时，可参考表6－1。

五、活性检验

1．滤纸酶活力的测定

取4支洗净烘干的20mL具塞刻度试管，编号后各加入粗酶液0．5mL和0．05 mol／L pH为4．5的柠檬酸缓冲液1．5mL，向1号试管中加入DNS溶液3mL以钝化酶活性，作为空白对照，比色时调零用。将4支试管同时在50℃水浴中预热5～10min，再各加入滤纸条50mg（新定量滤纸，约1cm×6cm），50℃水浴中保温1h后取出，立即向2、3、4号试管中各加入DNS溶液3mL以终止酶反应，充分摇匀后沸水浴5min，取出冷却后用蒸馏水定容至20mL，充分混匀。以1号试管溶液为空白对照调零点，在550nm波长下测定2、3、4号试管液的吸光度A₅₄₀，并记录结果。

根据3个重复吸光度的平均值，在标准曲线上查出对应的葡萄糖含量，按下式计算出滤纸酶活力。在上述条件下，每小时由底物生成1μmol葡萄糖所需的酶量定义为一个酶活力单位（U）。

2．C₁酶活力的测定

4支洗净烘干的20mL具塞刻度试管，编号后各加入脱脂棉50mg，加入0．05mol／L pH为5．0的柠檬酸缓冲液1．5mL，并向1号试管中加入DNS溶液3mL以钝化酶活性，作为空白对照，比色时调零用。将4支试管同时在45℃水浴中预热5～10min，再各加入酶液0．5mL，45℃水浴中保温24h。取出后立即向2、3、4号试管中各加入DNS溶液3mL以终止酶反应，充分摇匀沸水浴5min，取出冷却后用蒸馏水定容至20mL，充分混匀。以1号试管溶液为空白对照调零点，在550nm波长下测定2、3、4号试管液的吸光度并记录结果。

据3个重复吸光度的平均值，在标准曲线上查出对应的葡萄糖含量，按下式计算出C₁酶活力。在上述条件下反应24h，由底物生成1μmol葡萄糖所需的酶量定义为一个酶活力单位（U）。

3．C_x酶活力的测定

取4支洗净烘干的20mL具塞刻度试管，编号后各加入0．51%CMC柠檬酸缓冲液1．5mL，并向1号试管中加入DNS溶液3mL以钝化酶活力，作为空白对照，比色时调零用。将4支试管在50℃水浴中预热5～10min，再各加入粗酶液0．5mL，50℃水浴中保温30min后取出，立即向2、3、4号试管中各加入DNS溶液1．5mL以终止酶反应，充分摇匀后沸水浴5min，取出冷却后用蒸馏水定容至20mL，充分混匀。以1号试管溶液为空白对照调零点，在550nm波长下测定2、3、4号试管液的吸光度值并记录结果。

据3个重复吸光度的平均值，在标准曲线上查出对应的葡萄糖含量，按下式计算出C_x酶活力。在上述条件下，每小时由底物生成1μmol葡萄糖所需的酶量定义为一个酶活力单位（U）。

六、实训报告

写出书面报告，并着重分析实验存在的问题，包括成功的经验和失败的教训。

七、实训思考题

1．为什么用产物的生成量来定义酶活力单位而不用底物减少量来定义？

2．DNS为什么能钝化纤维素酶活力？

3．为什么在测定C₁酶活力和C_x酶活力时要稀释酶液？