菌种的保存

第五节　菌种的保存

在各种理化和生物学因素的影响下，微生物的生物学特性可能发生变异。为了进行微生物的基础研究和应用，需要保存一些标准菌株。因此，保存菌种是微生物实验室的一项基本工作。

保存细菌的要求是保持细菌存活，不污染杂菌，尽量少发生变异，保持菌株原有的生物学活性和培养特征。

保存细菌的方法很多，其基本原理是使细菌处于休眠状态，也就是说将其生命活动限制在最低限度。为达到这个目的，基本保存条件是干燥、低温和隔绝空气。细菌的各种保存方法都是根据这些基本条件设计的。兽医病原菌的保存常用继代培养、冷冻保存和冷冻干燥保存法。

一、继代培养保存法

继代培养保存法是保存病原菌的基本方法，既可以长期保存菌种，又能随时移植复苏，为微生物实验室最常采用的方法。其方法是选用对被保存细菌适宜的培养基，需氧或兼性厌氧菌常用如多塞氏鸡蛋培养基、营养琼脂斜面、血琼脂斜面、半固体培养基等；厌氧梭菌常用疱肉培养基。按常规方法接种细菌，37℃培养至生长菌苔或形成芽孢（厌氧芽孢杆菌），取出放在室温或4℃冰箱中保存，依菌种不同可每隔1～6个月继代移种一次。

1.注意事项

（1）继代培养应降低细菌的代谢活力，延长其存活时间，故培养基的营养成分不宜太丰富，而且培养温度应稍低于生长的最适温度。

（2）每株菌种应继代接种2管以上培养基，标明菌名及接种时间。

（3）在保存中应防止污染，棉塞应塞紧，避免在保存中掉出，棉塞底部应距离斜面培养基上端2cm以上，必要时在细菌充分发育后，切去棉塞外部分，用石蜡封口（适于病原真菌）。

（4）为防止斜面、液体和半固体培养基菌种保存过程中干燥，可用灭菌的橡胶塞代替棉塞，或改用螺旋帽盖。

（5）细菌在长期保存后有时会发生变异，其生理活性、病原性、芽孢或荚膜形成能力等会降低，应予充分注意，最好能定期对保存菌进行检验鉴定。如条件允许，在一定期限时应继代接种一次易感动物，以保持或恢复其生物学性状。

（6）在人工培养基上存活时间短的病原菌，如巴氏杆菌、弯曲杆菌或易发生变异的病原菌如布氏杆菌、鸡嗜血杆菌、金黄色葡萄球菌等不宜用此法。

2.常用培养基

（1）多塞氏（Dorset）鸡蛋培养基

将鸡蛋表面洗净，并用酒精棉擦净，打入灭菌容器中。打碎后按上述比例加入0.9% NaCl溶液，混匀，用铺有灭菌纱布的漏斗过滤，分装试管，摆成斜面，用血清凝固器间歇灭菌。

此培养基适于多种兽医病原菌的保存，尤其对含有荚膜或毒力抗原的病原菌的保存。在4℃可保存6～12个月。

（2）营养琼脂斜面：见培养基的制造。

此培养基适于多种兽医病原菌的保存。如炭疽杆菌在室温下可保存5年以上（用橡胶塞）。一般细菌在4℃冰箱内可保存30d。

（3）半固体培养基：用穿刺接种法将细菌接种，置温箱培养18～24h后，在表面加上一层无菌液体石蜡（约1ml），置4℃冰箱保存。一般细菌可保存3个月至半年。传代时应先将试管倾斜，使液体石蜡流至一边，再用接种针取菌接种于新培养基上。

（4）疱肉培养基：牛心脏浸出液（450g原料作成浸液）、蛋白胨20g、葡萄糖2g、氯化钠5g、蒸馏水加至1000ml。pH7.2，121℃高压蒸气灭菌15～30min。适用于厌氧梭菌的继代保存。

二、冷冻保存法

1.低温冰箱（－20℃）保存法

（1）操作方法：将保存菌接种液体培养基培养后，放在－20℃低温冰箱中。对多数病原菌都有良好的保存效果。

（2）注意事项：①为避免容器冻裂，应使用优良硬质玻璃试管或安瓿。②为避免冻裂，试管内菌液不能装满，一般以1～2ml为宜。③试管用橡皮塞或螺旋塞。如用棉塞时要用塑料薄膜包住棉塞。④培养液中加入10%～ 20%无菌甘油或血清。⑤冷冻菌株在取出解冻后，只能重新接种继代，不能用原管继续冷冻保存。

2.液氮保存法

将培养18～24h的菌苔洗下，置于无菌脱脂牛乳中，制成菌悬液，分装于无菌安瓿（每瓶0.1～1ml）。用喷灯封瓶口，并将封后的安瓿浸入4℃有色液体中浸30min，明确熔封后再冷冻。冷冻时先将安瓿放入4℃冰箱中1h，移置冰格放1h，再置－30℃～－20℃低温冰箱中冻结30min，然后移置－196℃液氮中保存。使用时，先将从液氮中取出的安瓿浸入30℃～40℃温水中迅速解冻，再打开安瓿，取出菌液接种。在液氮中取放安瓿要防止安瓿爆炸，小心取放。

三、冷冻干燥保存法

冷冻干燥法是先使细菌在极低温中快速冷冻，然后在低温下真空减压，利用升华现象从菌体除去水分，使细菌停止生理活动，其细胞结构和成分保持原来的状态，从而能够长期保存。本法适用于大多数病原微生物的长期保存。

1.冷冻干燥保存法的操作程序

增菌培养→悬浮于灭菌保护剂制成菌液→分装于灭菌菌种管→预冷→减压→熔封→真空度检查→保存。

2.具体操作

（1）菌液的准备：按照不同细菌的营养要求和培养条件，先在适当的培养基中作增菌培养，然后移植在保护剂中制成10⁹～10¹⁰个/ml细菌悬液。如为固体增菌培养基，可将保护剂注入试管内将斜面上的菌苔洗下，制成菌悬液；如为液体增菌培养基，在培养增菌后，离心，沉淀，倾去上清液，加入保护剂稀释成所需含菌浓度。

（2）保护剂：保护剂的作用是使悬浮于保护剂中的细菌在冷冻干燥过程中保持存活，并在复原时使休止状态的保存菌易于恢复生活发育状态。常用保护剂及其制法如下。

①10%甘油溶液。

②含牛血清白蛋白的10%甘油溶液：20%甘油1份，0.2%牛血清白蛋白1份，混合后过滤除菌。

③12%蔗糖培养基：取适宜该细菌增殖的灭菌培养基和24%过滤除菌蔗糖溶液等量混合，以无菌手续分装备用。

④10%脱脂乳：在微热的200ml蒸馏水中加入脱脂奶粉20g搅匀，用重叠数层的纱布过滤，分装小试管各5～6ml，115℃高压蒸气灭菌13min。

⑤加1%麸氨酸钠的10%脱脂乳：将20%（w/v）脱脂乳和2%麸氨酸钠等量混合，115℃高压蒸气灭菌10min。

（3）菌种管的准备：将球形菌种管或优质玻璃安瓿浸入2% HCl中过夜，取出后用自来水充分冲洗，最后用蒸馏水冲净，晾干，于160℃干热灭菌2～2.5h，使用时在管壁贴上注明保存的菌种名称、菌号、日期等标签。

（4）分装菌液：在无菌操作下用长针头注射器或毛细吸管，吸取菌悬液分装在菌种管或安瓿内，每管0.1～0.2ml，注意在分装时不要使菌液沾污菌种管颈部，塞好棉塞。

（5）预冷：预冷的目的是使水分在冷冰的状态下升华，以免在真空干燥时菌悬液沸腾外溢。预冷的温度要低，一般在－40℃～－30℃，速度要快，一般2～5min即可冻结，但为使菌液冻结坚固，应预冷1～2h或更长。常用的冷冻剂是在干冰（固体CO₂）中加入等量的无水乙醇（甲醇或丙醇亦可），混合后一般为－30℃以下，最低可达－72℃。在冷冻槽中放入冷冻剂，将已分装的菌种管插入冷冻剂中，1～2h即可坚固冻结。此外，也可以在液氮或－40℃以下低温冰箱中进行预冷。

（6）真空干燥：可用真空干燥机或用简易的真空干燥装置进行干燥。前者有各种型号，可按说明书的要求进行操作。

简易的真空干燥装置是由真空泵、冷凝器、真空表、干燥器连接而成的真空系统。全部真空系统的所有接头均用熔化的蜂蜡（等量的蜂蜡和松香）密封，并检查有无漏气处。检查时：开动真空泵抽气，5～10min后，若真空表显示的真空度达30mm汞柱，说明密封良好。冷凝器即为装有冷冻剂的容器。

简易真空干燥的操作方法是：在预冷后将冷冻的菌种管迅速移入干燥器内（在干燥器底层应预先放入适量干燥剂，如无水氯化钙或硅胶等）。开动真空泵抽气减压，开始15min内使真空达到0.5mm汞柱，随后逐渐达到0.2～0.1mm汞柱，到肉眼可观察到冷冻菌液干燥。由于菌种管数量和真空干燥装置的规格不同，所需要的时间也有较大差异。一般在4～8h。肉眼观察时可根据菌悬液的形状和颜色判断是否达到干燥。菌悬液在干燥后颜色发白，干固而疏松，稍加振动即离开管壁。必要时可在干燥器内放1～3支装有0.1～0.2ml的1%氯化钴牛乳液（预先与菌种管一起冻结）作为干燥指示管。若牛乳变为天蓝或深蓝色，即表示已干燥。

（7）熔封：真空干燥后，从干燥器取出菌种管，连接在封口装置上抽气，在保持真空的状态下，用酒精喷灯在菌种管颈部缓慢加热，逐渐将其拉长、熔封。熔封后应检查其真空度。常用高频电火花检测器进行检测，将通电的仪器尖端轻轻接触菌种管上半部（勿直接射向菌体），安瓿内真空放电并发出蓝紫色荧光时，表明已达到真空。

（8）干燥样品的保存：通常放在室温下或4℃保存，也可以在低温冰箱中（－25℃）保存。

（9）干燥样品的复苏

①启封：用酒精棉球消毒菌种管外表，用锉刀或砂轮片在其颈部锉痕，折断封口后要用无菌纱布或脱脂棉包盖颈部，以防止内部干燥病菌逸出，也可防止外部杂菌侵入。但不要用酒精棉球包盖开口，防止酒精进入菌种瓶内。也可用烧红的玻璃棒与割痕接触，菌种瓶颈部产生裂纹，在空气中放置0.5～1min，使空气徐徐进入瓶内，即可防止病原逸散。

②复苏：用无菌吸管将适于该种细菌生长繁殖的液体培养基0.3～0.5ml加入安瓿中，缓慢吸吹数次使团块完全溶解，再将其移种在液体培养基和斜面培养基各2～3管。细菌在保存中受到一定损伤，故第一次复苏应选用营养丰富的培养基。例如，加入血液、血清、半胱氨酸等可使存活率提高。

（10）注意事项：在菌液的制备、分装、预冷等过程中必须严格防止污染扩散。全过程所用的各种器械事后必须严格消毒。在真空干燥时应避免水气抽入真空泵的机油内，故应在干燥器与真空泵之间安装冷凝器，其冷凝温度应在－30℃以下。干燥完毕后应先关闭真空泵电源，然后缓慢放入空气，以防止机油被吸入干燥管道内。冻干菌种在启封时容易发生逸散或其他意外污染，故应在无菌罩内启封，并准备好消毒剂，以防万一。启封并移去菌液后的空安瓿（包括捏开的上端和碎片），用镊子收集在一个容器内，121℃高压蒸气灭菌20～30min，然后扔掉。致病性特强的病原微生物最好不用冷冻干燥法保存。如用此法保存，操作时须特别谨慎。