第四节 补体结合试验
补体是机体的一种重要的体液因子，属一组正常血清蛋白成分，可被抗原抗体免疫复合物激活产生具有裂解细胞壁的因子。如果该过程发生在红细胞表面上则导致红细胞裂解而出现溶血。利用这种反应来检测血清中的抗体或抗原，称作补体结合试验（complement fixation test，CFT）。
一、原理
CFT包括两个系统，第一为反应系统，又称溶菌系统，即已知抗原（或抗体），被检血清（或抗原）和补体。第二为指示系统（亦称溶血系统），即溶血素＋绵羊红细胞，溶血素即抗绵羊红细胞抗体。补体常用豚鼠血清，它对红细胞具有较强的裂解能力。补体只能与抗原－抗体复合物结合并被激活产生溶血作用。因此，如果试验系中抗原和抗体是对应的，形成了免疫复合物，定量的补体就被结合，这时加入指示系统，由于缺乏游离补体，就不产生溶血，即为阳性反应。反之试验系中缺乏抗原或特异性抗体，不能形成免疫复合物，补体就游离于反应液中，被指示系统，即溶血素＋绵羊红细胞免疫复合物激活，而发生溶血，即阴性反应。为了测定阳性血清中抗体的效价，可将血清作系列稀释，其结果是由完全不溶血逐步达到完全溶血，发生50%或100%溶血的血清最高稀释倍数为该血清的抗体效价。
在进行CFT主试验之前，抗原、补体、绵羊红细胞和溶血素必须经预备试验测定。所加补体的量必须准确，补体少导致不完全溶血，出现假阳性结果；反之，超量的补体不能被反应系统的免疫复合物完全结合，从而出现假阴性结果。超量的抗原影响补体的结合，抗原不足不能完全结合补体。
在CFT操作中，经常遇到的一个问题是被检血清存在“抗补体作用”。即被检血清在无抗原存在的情况下结合补体。这有多种可能的原因，主要原因是血清取自感染动物，在血清中存在免疫复合物；或者血清被细菌污染，通过其他途径激活了补体。
二、分类布体结合试验
1.直接法 该法为最常用的操作方法，在试管中加抗原、被检血清和补体，在一定温度下感作一定时间后，加溶血素和红细胞，再感作一定时间后判定结果。直接法又根据试剂量的差异分为常量法和微量法。常量法试剂总量一般为1.0～2.5ml，微量法一般为0.125ml。前者在试管内进行，后者在U形底的96孔微量反应板内进行。
2.间接法 该法用于禽类血清抗体的测定（如鸭、火鸡、鸡等）。因其血清抗体与相应的抗原形成复合物后不能结合豚鼠补体，需再加一种抗该抗原的兔抗体，后者形成复合物后可结合豚鼠补体，然后再加补体和溶血系统成分。与直接法相比间接法多加一种特异性免疫抗体，多进行一次感作。其结果判定正好与直接法相反。发生溶血时表示抗原已和血清中的抗体结合，阻止了兔抗体与抗原的结合，补体仍然游离存在，然后与溶血素结合，发生溶血，即为间接CFT阳性；反之，若血清中无相应的抗体存在，抗原则与兔抗体结合形成免疫复合物结合补体，不发生溶血，即为间接CFT阴性。
3.固相法 固相法的原理与直接法相同，其不同点是所有的反应是在琼脂糖凝胶反应皿中进行。其操作程序为先将溶血素致敏的红细胞液加入溶化后冷至55℃的1%琼脂糖凝胶中，混匀，倾注入特制的塑料反应皿内（反应皿规格为90mm×25mm，凝胶量为25ml）。待其凝固后打孔，孔径为6mm，孔距不得小于8mm。然后将在37℃温箱中感作一定时间的抗原＋被检血清＋补体的混合物取25μl加入孔中，37℃感作一定时间，观察溶血环的直径以确定结果的阴阳性。
三、抗体稀释法补体结合试验
（一）材料准备
1.抗原 将病毒、细菌、立克次氏体和原虫等经适当处理后，均可作为补体结合抗原。在制备病毒抗原时，需对原始病毒材料进行适当纯化，以提高抗原的特异性，通常反复冻融后再离心沉淀，去除细胞碎片，用丙酮、乙醚抽提以去除脂类物质，用去氧胆酸钠和吐温－80处理，使病毒粒子分散，逸去病毒抗原，也可用其他理化方法加以提纯。细菌通常用酚法提取菌体抗原（脂多糖），钩端螺旋体、锥虫等可使用裂解剂制备出菌（虫）体裂解抗原。目前已有许多市售的商品化抗原供使用。
在制备某些病毒、立克次氏体和原虫的抗原时，需用同一未接毒的正常组织、细胞培养或鸡胚培养液，用同法处理作为正常抗原对照。
2.血清 被检血清按常规方法采集，最好在次日晨喂饲前采集，以免血清中混有脂类物质，出现抗补体作用。阳性血清通常用兔或豚鼠制备，也可采用病愈后的康复血清。采集的血液血清析出后及时离心分离，以免溶血。血清在检验之前需进行灭活，灭活温度视动物种类不同而异，牛、马和猪的血清一般用56℃～57℃，山羊和绵羊血清用58℃～59℃，驴、骡血清为63℃～64℃，兔血清为63℃，人血清用60℃，用60℃以上温度灭活的血清可先将血清作l∶2或1∶5稀释，以免凝固、变性，灭活时间一般为30min。
3.补体 通常用3～5只健康雄性豚鼠混合血清作补体，以避免个体差异。采血前一天下午禁食，次日空腹采血，取血后放入4℃冰箱，2～3h内分离血清，立即分装小瓶，于低温冰箱冻结保存，可使用1个月，也可从生物药厂购买冻干补体。新鲜补体室温下保存时间为24h左右。
4.绵羊红细胞 自健康绵羊采集脱纤血液，加入等量阿氏（Alseluer's）液，4℃冰箱可保存1个月，用前吸出所需量，加5～10倍生理盐水，反复洗涤3次，最后用3000r／min离心20min，按压积红细胞量加生理盐水配成所需浓度的红细胞悬液，或1%或2%或2.5%或4%等。
5.溶血素 系用绵羊红细胞多次免疫家兔制成，可从生物制品厂购得。
6.稀释液 有生理盐水、钙镁盐水、巴比妥缓冲液（VB液）、明胶巴比妥缓冲液（GVB液）等。
在作补体结合试验时，无论采用那种方法，从预备试验开始一直到正式试验为止，要求做到所用的稀释液一致、红细胞浓度一致、各成分（抗原、血清、补体、溶血素、红细胞）的加入量一致，每管最后的总量相同（或0.6ml，或1.25ml或2.5ml），有些对照管，省去了某成分，应以稀释液补充其省去的量。
（二）预备试验
1.溶血素效价测定
（1）溶血素的稀释：取0.2ml含等量甘油防腐的溶血素，加9.8ml稀释液配成1∶100基础稀释液，按表7－8方法作进一步稀释。
表7－8 溶血素稀释法 单位：ml
（2）溶血素效价：按表7－9加入各成分，而后37℃～38℃水浴20min。
从水浴中取出，立即判定结果，用其1∶20补体0.25ml，在37℃～38℃水浴20min，能使2.5%红细胞液0.25ml完全溶血的最小量溶血素为溶血素效价或称一个单位溶血素。以7-9表为例，对照管均不溶血，1～6管完全溶血，则溶血素效价为1∶3000倍。在正式试验时溶血素的工作效价为滴定效价的倍量或称2单位溶血素，则工作效价。为1∶1500倍稀释。效价测定后的溶血素，可在2～3个月内按此效价使用，不必重测。
表7－9 溶血素效价测定表 单位：ml
2.补体效价测定 每次补体结合试验，应于当日测定补体效价。用稀释液将补体作1∶10稀释，按表7－10加入各种成分后，前后经37℃～38℃20min水浴2次。
表7－10 补体效价测定方法之一 单位：ml
注：＃完全不溶血，＋＋＋微溶血，＋＋50%溶血，＋微不溶血，－全溶血。
补体效价，即在2单位溶血素存在情况下，阳性血清加抗原的试管完全不溶血，而在阳性血清未加抗原及阴性血清无论有无抗原的试管发生完全溶血所需的最小补体量，就是所测得的补体效价。如表7-10中的第6管10倍稀释的补体0.1ml即为一个单位补体。在使用时原补体应稀释倍数的计算方法为：
即此批补体应作25倍稀释每管加0.25ml即为工作量补体或一个单位补体。因补体性质不稳定在操作过程中会降低。故使用时稀释的浓度比原效价高10%左右，即本批补体应作1∶22倍稀释，每管加0.25ml。
另外，补体效价也可用下述方法进行测定，即取三列试管，按表7－11加入各种成分，第一列加标准抗原，第二列加正常（组织）抗原，第三列不加任何抗原，而加钙镁盐水。各列均加入含量不同的补体，37℃水浴30min后加入致敏红细胞，振摇后37℃水浴30min，判定结果。
表7－11 补体测定方法之二 单位：ml
续表
有标准抗原、正常抗原、无抗原的三排管中，能使红细胞全部溶解的最小补体量为一个补体单位，表7－11例的10倍稀释补体，0.11ml即为1个单位补体，在正式试验使用时，其原补体的稀释方法与补体测定方法之一相同。
3.抗原效价测定 将标准阳性血清和标准抗原分别作倍比稀释（2×～128×）共7个稀释度进行方阵滴定。按表7－12加入抗原和血清各0.25ml，然后分别加入工作量补体0.25ml，并补足对照管中的稀释液（或钙镁盐水）量，将各管摇匀，置37℃水浴1h，病毒抗原多用4℃过夜，次日取出置37℃水浴20mim。各加入致敏红细胞0.5ml，振荡混合后，再置37℃水浴20min，判定结果。
表7－12 抗原效价测定示例
注：“＃”——完全抑制溶血，即不溶血。
“＋＋＋”——75%抑制溶血，即25%溶血。
“＋＋”——50%抑制溶血，即50%溶血。
“＋”——25%抑制溶血，即75%溶血。
“－”——完全溶血。
在标准抗原、阳性血清、正常抗原及正常血清对照成立无误的情况下，能与最大稀释倍数的阳性血清发生完全抑制溶血的抗原最大稀释倍数，为1个抗原单位，反之亦然。
表7－12示例：抗原1∶32，阳性血清1∶16各为1个单位。正式试验时，采用2或4个单位，即抗原用1∶16或1∶18，阳性血清1∶8或1∶4。
4.溶血度标准比色管的制备为了正确判定溶血程度，可利用试验中完全溶血的溶液混合，作为溶血溶液，按表7－13配制。
表7－13 标准比色管的配制及反应判定标准 单位：ml
（三）正式试验
1.定量试验 每一待检血清用10支试管，第1～6管加不同稀释倍数的待检血清，7、8两管加正常组织的抗原对照，9、10两管为血清抗补体对照。按表7－14加入反应的各种成分，振荡后，置37℃，或置4℃冰箱过夜，取出温热至37℃，然后加入致敏红细胞，振荡后，置37℃水浴30min，观察结果。
表7－14 正式试验（定量试验）操作程序表 单位：ml
以能抑制溶血在“＋＋”以上的血清最大稀释倍数为该血清的补体结合效价，如7-14示例表可知该血清效价为l：32。
为验证正式试验是否成立，还应按表7－15加入各种成分，作为阳性血清、阴性血清对照以及补体单位对照，如结果与表中的预期结果不符，试验作废，应重做。
表7－15 正式试验中的阴、阳性血清和补体对照 单位：ml
2.定性试验 每份被检血清作1∶5或1∶10稀释经灭活后加入试管内，每管0.25ml，其中1管加工作量抗原0.25ml，另一管加稀释液0.25ml，每管加入工作量补体0.25ml，摇匀置37℃水浴30min，或4℃过夜，取出加热至37℃，每管加两单位溶血素0.25ml和2.5%红细胞悬液0.25ml，摇匀置37℃水浴30min，取出进行判定。每次试验应设标准阳性血清、阴性血清、补体、抗原、溶血素以及红细胞对照。试表7－16加入反应的各种成分。
表7－16 正式试验（定性试验）操作程序表 单位：ml
在各项对照试验正确无误的条件下，可对被检血清进行判定，被检血清加抗原管为0%～50%溶血判为阳性，60%～80%溶血判为疑似，90%～100%溶血判为阴性。在进行溶血程度的判定时可比照标准比色管记录结果。
四、补体稀释法补体结合试验
1.材料准备 同抗体稀释法补体结合试验
2.预备试验
（1）溶血素效滴定：将稀释成1∶1000、1∶2000、1∶3000直至1∶9000不同稀释倍数的溶血素，分别滴入微量板的第1～9孔，每孔1滴，然后依次加入40×补体，每孔两滴；加GVB液每孔2滴，加入4%红细胞悬液每孔1滴，置37℃水浴10min，观察结果。红细胞全部溶解的溶血素最大稀释度为1个溶血素单位，正式试验时，用2个溶血素单位。
（2）补体效价滴定
用9支试管按表7－17加入GVB液，吸取补体1ml加入第1管，混匀后吸7ml于第2管，依次顺序稀释至第9管。
表7－17 补体稀释和滴定法 单位：ml
用标准滴管吸取上述稀释补体于96孔微量板上第1～9孔，每孔2滴，然后加入已知阴性抗原和2×标准阴性血清每孔分别各1滴，置4℃冰箱过夜，次日取出，每孔加致敏红细胞悬液2滴，振摇后，置37℃水浴30min，观察结果，若测得的结果如表7－18，则此补体效价在第五孔，即相当于补体稀释的第五管。
表7－18 补体效价测定结果
以后进行正式试验时，要用几个不同的补体量（多于1个效价及少于1个效价的），补体量足以全溶、部分溶和不溶的几个孔，如上例3～9孔，即补体稀释的3～9管。
（3）标准比色管的制备：为了提高判定的正确性，需先配制标准比色管，分别滴入微量板的1～11孔，每孔6滴作为标准。各试验孔溶血程度与标准对比后，记录溶血值。制备标准比色管时，需先配制红细胞溶血液和3倍稀释的致敏红细胞悬液。取致敏了的4%红细胞悬液2ml加双蒸水6ml，冻融数次使红细胞完全裂解即为红细胞溶血液。取2ml致敏了的4%红细胞悬液加6ml GVB淮，再加甲醛2滴以防溶血，即为3倍稀释的致敏红细胞悬液。
表7－19 标准比色管的配制法和溶血程度的判定
（4）抗原效价滴定：用阳性抗原和阴性对照抗原分别与标准阳性血清和GVB液作用，以9个不同稀释度的补体按表7－20作抗原效价滴定。
表7－20 抗原效价滴定表 单位：滴
判读各孔的溶血值（与标准比色管比较）如表7－21溶血值判定。
表7－21 溶血值判定
第一列溶血值总和为8.1，第二列为2.7，二者差为5.4；第三列、第四列溶血值总和均为3.5，二者差为0。这两个差（5.4与0）是抗原效价。要求三列与四列的差是零，否则表明抗原不好；并要求一列与二列的差大于5。
3.正式试验 试验在96孔微量板上进行，将被检血清作2×或5×稀释后，灭活，每一检样做二列，每列做7个孔，1～7孔的补体稀释度同补体稀释方法的3～9管。操作时按表7－22加入各成分。
表7－22 正式试验操作程序和结果举例 单位：滴
在进行正式试验时应设阳性血清和阴性血清对照，阳性血清对照的效价（阳性抗原与对照抗原的差）应在5.0以上，阴性血清对照应为0。以第一列的溶血值的和减去第二列溶血值的和，即为该被检血清的效价，效价在0.8以上者判为阳性，在0.2以下者判为阴性。介于0.3～0.7者为疑似，应进行重试，重试后仍在0.3以上者判为阳性，在0.2以下者判为阴性。
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