其他血清学技术

第六节　其他血清学技术

一、病毒蚀斑技术

1952年，Dulbecco把噬菌体空斑技术应用于动物病毒学，从而使病毒蚀斑技术（Virusplaque formation）成为许多病毒的滴定和研究方法。

（一）原理

病毒感染细胞后，由于固体介质的限制，释放的病毒只能由最初感染的细胞向周边扩展。经过几个增殖周期，便形成一个局限性病变细胞区，此即病毒蚀斑。从理论上讲，一个蚀斑是由最初感染细胞的一个病毒颗粒形成的，因而该项技术常用于病毒颗粒计数和分离病毒克隆。但在实际操作中，常出现几个病毒颗粒同时感染一个细胞的情况，影响滴定的准确性和克隆的纯一性。为此，接种的病毒液要充分分散和稀释。对于细胞结合性病毒，如MDV，需用单层细胞；对细胞释放性病毒，即可用固相介质悬浮的细胞，也可用单层细胞，但后者需用琼脂等固体介质盖在细胞上，以防释放的病毒在液体介质中流动。固体介质的浓度由病毒的大小而定，大病毒用浓度较低的介质，小病毒用浓度较高的介质，以便将蚀斑的生长速度控制在适宜的范围内。小蚀斑需用显微镜观察，1～10mm的大蚀斑可用肉眼计数。为便于肉眼观察，常用中性红等染料染色。因病变细胞不吸收中性红，病变细胞区便呈现无色蚀斑。病毒悬液的滴度以每毫升蚀斑形成单位（PFU/ml）来表示。

（二）技术

应用蚀斑技术可以应用于分离病毒的克隆（无性繁殖纯系）、病毒或血清的滴定，也可用蚀斑形态和大小研究病毒的生物学特性。

1.病毒生物学纯化（virus biological purification）在进行血清中和试验时，常常会出现标准病毒株的滴度下降，因而影响了试验的准确性，这种情况多见于虫媒病毒。这可能是由于原始毒种的混杂，或者已有许多变异病毒粒子存在其中，甚至出现数量众多的缺陷病毒所致。这时，有必要把手上掌握的标准毒株进行纯化，应用病毒蚀斑技术，挑选出各个不同的纯化病毒，亦称“克隆株”。克隆后的病毒经在敏感细胞上增殖，测定其滴度，选用合适的毒株用于血清中和试验。为了更有效地进行纯化，必须在覆盖营养琼脂之前用营养液洗去单层细胞上未被吸附的病毒。同时要控制好稀释的浓度，一个培养瓶中的蚀斑数目最好不超过10个，挑取在其附近10mm都是健康细胞的蚀斑。挑取后的病毒应传两代或两代以上。一般认为，中性红染料会由于“光敏”作用而抑制病毒蚀斑的形成和破坏宿主细胞。因此，加了中性红覆盖层的培养物应在暗处培养。

2.蚀斑减少中和试验（plaque reduction neutralization test）蚀斑减少中和试验是检测血清中和抗体的一种敏感性较高的方法。试验以使蚀斑数减少50%的血清稀释度作为其中的效价。试验使用定量的病毒（100PFU）与不同稀释度的等量血清混合后感作，接种预先准备好的单层细胞，再覆盖营养琼脂置37℃二氧化碳培养箱培养，数天后分别统计蚀斑数，用Karber法计算该血清的蚀斑中和效价。其操作原理与传统的血清中和试验大致相同。

由于本试验的操作比较繁琐，目前在国内极少应用，国际上也没有把它作为一种各国都接受的诊断方法，仅在OIE国际动物卫生法典（第六版）中列为对裂谷热的规定诊断方法之一。

3.操作步骤

（1）病毒的滴定或纯化

①在灭菌的培养皿中培养合适的细胞，使形成单层。细胞培养时间为3～4天，接种量约为200万个细胞/ml。选取单层细胞全部覆盖，不留有空洞的培养皿用做试验。

②用细胞培养液对病毒作10倍倍比稀释至10^－7并保存于4℃。

③每个稀释度的病毒液接种3个平皿。

④接种前弃去细胞培养液，用5ml PBS或细胞培养液冲洗单层细胞，然后弃去冲洗液。

⑤每个平皿分别加入0.2ml病毒稀释液，对照组只用细胞培养液代替，置37℃二氧化碳培养箱吸附1h，每15min摇动一次，以便使病毒均匀分布。

⑥按步骤④冲洗未被吸附的病毒。

⑦取2倍浓缩的细胞培养液加入等量的1.6%琼脂（预热）中，每个平皿加入7ml，置平台待冷却凝固后于37℃二氧化碳培养箱培养约2d，平皿需倒置。

⑧取2倍浓缩的细胞培养液加入等量的2%琼脂（预热）中，每个平皿加入5ml，置平台待冷却凝固后于37℃二氧化碳培养箱培养至次日。

（2）结果计算：求出每组3个培养皿的蚀斑平均数，组间蚀斑数的差异应符合稀释度的规律（即若10^－2组平均100个蚀斑，则10^-3组平均应在10个左右），否则应考虑重新试验。以平均蚀斑数乘以病毒稀释的倍数再乘以5，即为每毫升病毒原液的蚀斑数。

选取特征性的若干蚀斑，分别以弯头吸管在琼脂层下吸取蚀斑以收获病毒，然后分别接种到预先制备的单层细胞培养瓶中进行增殖或传代。

（三）病毒血清型鉴定试验（纸片法）

1.抗体纸片制备

（1）取已知各种血清型毒株以1×10⁷蚀斑形成单位接种绵羊，接种后3～4周采血分离血清。

（2）制备直径0.5mm的中性滤纸片，121℃15min灭菌后保存于干燥环境。

（3）取上述滤纸片浸入不同血清型的免疫血清后真空冻干，保存于4℃冰箱备用，使用前以灭菌水湿润。

2.病毒接种

（1）用直径6cm的塑料培养皿培养BHK₂₁或Vero细胞使成单层。

（2）以10³PFU/0.2ml被检病毒接种于细胞上，吸附1h。

（3）洗去未被吸附的病毒，弃去洗液。

3.覆盖琼脂

（1）取2倍浓缩的细胞培养液加入等量的1.6%琼脂，每个平皿加入7m1，置平台冷却凝固。

（2）在琼脂面上按梅花形图案放上不同型的血清滤纸片，并做好记号。

（3）把平皿放置在37℃二氧化碳培养箱培养2d。

（4）真空吸出平皿中的滤纸片。

（5）取2倍浓缩的细胞营养液加入等量的2%琼脂，每个平皿加入5ml，重新置37℃二氧化碳培养箱培养2～3d，待明显蚀斑抑制环出现。

4.结果判定：出现明显抑制蚀斑形成（即滤纸片位置下仍保持活细胞被染色）的免疫血清即为该被检病毒的血清型。

（四）病毒（NDV）分离

1.取疑似患病动物的组织用细胞培养液匀浆，离心沉淀后取上清液。

2.用16孔微量培养板制备鸡成纤维原代细胞。

3.细胞长成单层后吸去培养液，向每孔滴加0.1ml被检病料，置37℃吸附2h后弃残液。

4.制备1%琼脂的BME，置40℃～50℃水浴待用。

5.吸取上述琼脂加入培养板各孔，每孔0.5ml，使冷却凝固成覆盖层。

6.把培养板倒置，在37℃二氧化碳培养箱培养48h。

7.制备含0.002%中性红的1%琼脂的BME，置40℃～50℃水浴待用。

8.吸取上述琼脂加入培养板各孔，每孔0.5ml，使冷却凝固成第二覆盖层。

9.把培养板倒置，在37℃二氧化碳培养箱继续培养，48h内观察结果。

10.挑出蚀斑下的细胞作病毒的进一步增殖和鉴定。

注：本试验方法在样品中病毒含量少的情况下比单纯用细胞培养分离要敏感。

（五）试验用各种成分的配制

1.细胞营养液（用于稀释病毒）

2.两倍浓缩细胞营养液（配制首层琼脂用）

3. 31.6%琼脂

（121℃高压灭菌15min，置40℃～45℃水浴备用）

4.含中性红两倍浓缩细胞营养液（配制第二层琼脂用）

（置40℃～45℃水浴备用）

说明：在第二层琼脂中，中性红的最终浓度应为1∶5000～1∶10000

（112℃高压灭菌15min，置40℃～45℃水浴备用）

二、变态反应

变态反应（Allergy）是指已免疫的动物机体在接触同一种抗原物质时所发生的一种异常反应，也叫超敏反应（Hypersensitivity）。在抗原抗体反应中，外来抗原所引起的免疫应答对大多数反应个体是有利的。但是有些应答反应能导致组织损伤，使机体生理功能紊乱，甚至休克死亡。变态反应的实质就是这种过强的病理性应答反应，其引发的疾病称变态反应性疾病或免疫性疾病。常见变态反应性疾病有全身性的，如过敏性休克、血清过敏等；有局部性的，如发生在呼吸道的支气管哮喘、喉头水肿、过敏性鼻炎；发生在皮肤的荨麻疹、湿疹；发生在消化道的呕吐、腹痛、腹泻等。

变态反应的发生有致敏阶度和反应阶段。初次抗原刺激，经一定的潜伏期，机体进入致敏状态，再受到同样抗原的刺激时进入反应阶段。变态反应发生发展过程，一般具有以下几个特点：①需有过敏原的刺激；②过敏原高度特异性，两次过敏原必须相同；③需经一定潜伏期，先使机体致敏；④变态反应的表现与反应的程度既决定于抗原的质和量，也决定于机体的差别。

（一）变应原

引起变态反应的抗原称为变应原（allergen）或过敏原（anaphylactogen）。变应原种类很多，可以是完全抗原，如微生物、寄生虫、昆虫毒液、异种动物血清和组织提取物、疫苗、动物皮毛和饲料等；也可以是半抗原，如青霉素、磺胺类、阿司匹林等常用药物和有机碘、汞剂等一些化学制剂，这些半抗原只有与蛋白质结合后才表现变应原性。

（二）变态反应分类

变态反应发生的原因不一，临诊表现各异，Cool和Gell等人将其分为四个主要类型，即Ⅰ型（过敏反应）、Ⅱ型（细胞毒型）、Ⅲ型（免疫复合物型）和Ⅳ型（迟发型）。前三型均系抗体与抗原在体内反应所引起，属体液性变态反应。其共同点是反应发生较快，有的在数分钟内达到反应高峰，常称炎性速发型变态反应。第Ⅳ型为细胞介导免疫应答，反应发生缓慢，一般在6～48h才达到反应高峰，故称为迟发型变态反应。也有提出V型和Ⅵ型。因V型为细胞刺激型，Ⅵ型是抗体杀伤细胞的一种类型，两者均被视为Ⅱ型反应范畴，故大多数人仍采用四型分类法。变态反应虽有四种类型，但任何一种抗原引发的变态反应均由一种或数种机制引发。临诊上的变态反应也常常几种合并存在，以某一型为主。

（三）各型变态反应

（1）I型变态反应　出现迅速、反应强烈。反应可限于一种组织，也可波及全身。所表现的症状和严重程度差异较大、但很多时候是致命性的全身反应。该型常称过敏反应（anaphylactic reaction）。机体受到变应原刺激后，产生相当量的IgE抗体。IgE具有亲细胞的特性，通过Fc段结合在组织中的肥大细胞和血流中的嗜碱性粒细胞表面，结合后的IgE比较稳定，此时，机体处于致敏状态。这种致敏状态常于第一次接触抗原后二周开始形成，可维持半年至数年。以后若再无同种抗原刺激，致敏状态便逐渐消失。

机体致敏后，当同种变应原再次进入时，便与肥大细胞或嗜碱性粒细胞表面的IgE结合，单个变应原分子可与至少两个相邻近的IgE分子结合，联结成桥状的变应原－IgE复合物。形成的复合物能激活肥大细胞和嗜碱性粒细胞，促使细胞内多种嗜碱性颗粒被排出。这些脱出的颗粒和细胞释放出各种生物活性介质，如组织受体、5－羟色胺等，同时血浆中的激肽原被活化成激肽。这些活性介质作用于相应的组织器官，引起毛细血管扩张，血管壁通透性增加，平滑肌收缩，腺体分泌增多等。I型变态反应虽然发生快而强烈，甚至导致突然休克，但消退亦快，补体不参与反应，所以仅能引起生理机能紊乱，而无后遗性组织损伤；发病有明显的个体差异，只有过敏性体质的机体才易发生。

2.Ⅱ型变态反应　是抗体（IgG或IgM）与相应的细胞或组织上的抗原结合，在补体、巨噬细胞和K细胞的参与下，造成细胞溶解、损伤，或被单核细胞所吞噬的反应，也称为细胞毒型（cytotocictype）变态反应，临诊上许多免疫性血液病均属此型。

3.Ⅲ型变态反应　是由免疫复合物所引起，因此称为免疫复合物型（immune complextype）或脉管炎型（vaseultitis type）。该型变态反应与免疫复合物的大小有密切关系。临诊表现与反应的部位有关。当抗原进入已免疫的机体内，与抗体（IgG、IgM）在循环或体液中结合，形成中等大小的抗原-抗体复合物，若能及时被清除，便沉积于局部毛细血管壁基底膜，激活补体、导致中性粒细胞聚集，引起血管炎病，危害机体。

本型变态反应可以引起局部免疫复合物病，如阿萨斯（Arthus）反应和全身的血清病样反应。阿萨斯反应是在注射抗原的局部形成免疫复合物，致使局部发生水肿、出血、坏死的剧烈炎性反应。血清病样反应是动物初次接受血清注射后产生的抗体与尚未完全清除的抗原结合成中等大小的循环免疫复合物而引起。因免疫复合物可经循环遍布全身，故常引起全身反应，如发热、皮疹、淋巴结肿大等。某些药物如青霉素、磺胺等，如长期使用，也能发生类似的血液病样反应，称药物热。

4.Ⅳ型变态反应　是机体再次接触同种抗原许多小时后发生的一种以细胞免疫局部反应为主的反应。所以称为迟发型变态反应（delayed allergy）或细胞介导型（cell－mediate type）。在该型反应中抗体不起作用，也无补体参与，而由致敏淋巴细胞（T细胞）、单核巨噬细胞等聚集于反应局部引起免疫损伤。该型反应主要有传染性变态反应、接触性皮炎、移植排斥反应和自身免疫性变态反应。引起Ⅳ型变态反应的变应原可为微生物、寄生虫和异体组织等，也可以是半抗原。当这类抗原进入体内后，刺激T淋巴细胞引起分化增殖，转化为致敏淋巴细胞，使机体进入致敏状态，此阶段需1～2周。当机体再次接触同种变应原时，刺激致敏淋巴细胞释放各种淋巴因子，主要有巨噬细胞趋化因子、巨噬细胞移动抑制因子和巨噬细胞活化因子。这些因子加速骨髓单核-巨噬细胞增殖、释放，并向抗原部位集中，发挥吞噬作用，引起以单核细胞浸润为主的局部炎症反应。同时巨噬细胞释出的溶酶体酶能损伤邻近组织细胞，使组织变性和坏死。再加上皮肤反应因子和淋巴毒素的作用，使局部毛细血管通透性增加而充血、水肿。在反应中，杀伤T细胞能识别靶细胞表面抗原，与之结合，直接杀伤靶细胞。该型变态反应是以淋巴细胞和巨噬细胞为主的渗出性炎性反应。由于细胞的激活、增殖、分化和聚集需要时间长，反应发生较缓慢，一般在再次接触抗原6～48h，反应才达高于某些胞内寄生菌（如结核杆菌、副结核杆菌、布氏杆菌等）和病毒等外来抗原的细胞免疫力。由于反应过于强烈，造成组织的严重损伤，于机体不利；如果是组织移植，这种反应显然有害。迟发型变态反应具有明显的利用之处。传染性变态反应，常常用来作为某些慢性传染病的诊断依据。如结核、副结核、马鼻疽、布氏杆菌病、野兔热、马流行性淋巴管炎等，就是明显的例子。

（四）动物疫病的变态反应诊断

某些传染原引起的传染性变态反应，具有很高的特异性，可用于传染病诊断。在动物疫病诊断检疫中，常用的方法有皮内反应法、点眼法和皮下反应法。抗原制剂有鼻疽菌素、结核菌素、布氏杆菌水解素、副结核菌素等。接种的部位因动物种类和传染病而异，马采用颈侧和眼睑；牛、羊除颈侧外，还可在尾根及肩胛中央部位；猪大多在耳根后，鸡在肉髯部位，猴在眼睑或腹部皮肤。各种抗原制剂接种的剂量也有不同，可参见使用说明。

1.牛结核菌素变态反应检验　牛结核菌素变态反应检验有三种方法，即皮内反应、点眼反应及皮下反应。我国主要采用前两种方法，两种方法最好同时并用。

（1）结核菌素皮内反应

①注射部位：在左颈侧中部上1/3处（3个月以内犊牛可在肩胛部）。先剪毛，直径约10cm，然后用卡尺测量术部中央皮皱厚度。如术部有创伤、化脓或硬结等变化时，应另选部位或在对侧进行。

②注射剂量：用结核菌素原液，3个月以内的小牛0.1ml；3个月至1岁牛0.15ml：1岁以上的牛0.2ml。

③注射方法：先用酒精棉球消毒术部，然后向皮内注入规定量的结核菌素原液，注射后注射部位应出现豆大小泡，如注射不正确或有疑问，应另选术部重作。每注射一头牛后，用酒精棉球擦拭针头。

④观察反应：皮内注射后，应分别在72h、120h进行2次观察，注意局部有无热、痛、肿胀等炎性反应，并以卡尺测量术部肿胀面积及皮皱厚度。

在第72h观察后，对呈阴性及可疑反应的牛只，需在原注射部位，以同一剂量进行第2次注射。第2次注射后应于第48h时（即120h）再观察一次。

（2）判定

阳性反应：局部发热、有痛感并呈现界限不明显的弥漫性水肿，质地如面团，肿胀面只在35mm×45mm以上，或上述反应较轻，而皱皮厚度在原测量基础上增加8mm以上者，为阳性反应，其记录符号为（＋）。

疑似反应：局部炎性水肿不明显，肿胀面积在35mm×45mm以下者，皮厚增加在5～8mm间，为疑似反应，其记录符号为（±）。

阴性反应：局部无炎性水肿，或仅有无热坚实及界限明显的硬块，皮厚增加不超过5mm者，为阴性反应，其记录符号为（一）。

2.结核菌素点眼反应　牛结核菌素点眼，每次进行两回，间隔3～5d。

（1）方法：点眼前对两眼作详细检查，正常时方可点眼；有眼病或结膜不正常者，不可作点眼检疫。结核菌素一般点于左眼，左眼有眼病可点于右眼，但需在记录上说明。用量为3～5滴，0.2～0.3ml。点眼后，注意将牛拴好，防止风沙侵入眼内，避免阳光直射及牛头部与周围物体摩擦。

（2）观察反应：点眼后，应于第3h、6h、9h各观察一次，必要时可观察第24h的反应。应观察两眼的结膜与眼睑肿胀的状态，流泪及分泌物的性质与量的多少。由于结核菌素而引起的饮食减少或停止以及全身战栗、呻吟、不安等其他变态反应，均应详细记录。阴性和可疑的牛72h后，于同一眼内再点一次结核菌素，观察记录同上。

（3）判定

①阳性反应：有两个大米粒大，或有2mm×10mm以上的呈黄白色的脓性分泌物自眼角流出，或散布在眼的周围，或积聚在结膜囊及其眼角内，或上述反应较轻，但有明显的结膜充血、水肿、流泪并有其他全身反应者，为阳性反应。

②疑似反应：有两个大米粒大，或有2mm×10mm以上的灰白色、半透明的黏液性分泌勿积聚在结膜囊内或眼角处，并无明显的眼睑水肿及其他全身症状者，判为疑似反应。

③阴性反应：无反应或仅有结膜轻微充血，流出透明浆液性分泌物者，为阴性反应。

④综合判定：结核菌素皮内注射与点眼反应两种方法中的任何一种呈阳性反应者，即判定为结核菌素阳性反应牛；两种方法中任何方法为疑似反应者，判定为疑似反应牛。

⑤复检：在健康牛群中（即无1头变态反应阳性的牛群）经第二次检疫判定为可疑的牛，要单独隔离饲养，一个月后作第二次检疫，仍为可疑时，经半个月作第三次检疫，如仍为可疑，可继续观察一定时间后再进行检疫，根据检疫结果作出适当处理。

3.牛副结核变态反应检验：为了查清隐性副结核病牛，可以用副结核菌素或禽型结核菌素作皮内变态反应检查。其注射剂量为：1月龄至1岁的牛0.1ml；1岁以上至3岁0.2ml；3岁以上0.3ml。其注射部位、注射方法、反应观察、判定标准与牛结核皮内变态反应基本相似。对皮内反应疑似牛，应做好明显标记，经15～30d再作第2次皮内反应，如仍为疑似反应，再以同样间隔作第3次检查。重检时应另选注射部位。对连续3次疑似反应牛，应酌情处理。

4.布氏杆菌变态反应检验　布氏杆菌变态反应试验，是用不同类型的抗原进行布氏杆菌病诊断的方法之一。布氏杆菌水解素（即变态反应试验的一种抗原），是专用于绵羊及山羊的布氏杆菌病变态反应检查。

如果在牛群中发现有开放性结核牛，同群牛如有可疑反应的牛只，也应视为被感染。通过两次检疫都为可疑者，即可判为结核菌素阳性牛。

（1）操作步骤：使用细针头，将布氏杆菌水解素注射于羊尾根皱褶或肘关节无毛处皮内，剂量为0.2ml。注射前应将注射部位用酒精棉消毒，每注射1只羊，均需用酒精棉消毒针头。如注射正确，会在注射部位形成绿豆大的硬包。布氏杆菌病羊在注射部位发生炎性反应（水肿，略潮红），而健羊则无此反应。

（2）结果判定：注射后24h和48h各观察1次（用肉眼观察和触诊方法检查注射局部反应）。若两次观察反应结果不符时，以反应最强的一次作为判定依据。判定标准是：

强阳性反应（＋＋＋）：注射部位有明显不同程度的肿胀和发红（硬肿或水肿），无需触诊凭肉眼即可察出者。

阳性反应（＋＋）：肿胀程度不如上述现象明显，但也容易看出。

弱阳性反应（＋）：肿胀程度也不显著，有时需靠触诊才能发现。

疑似反应（±）：肿胀程度似不明显，通常需与对侧比较才能察觉者。

阴性反应（-）：注射部位无任何变化。

可疑反应羊经30d后复检。复检如无反应，即以健康羊对待；如仍为可疑，则按阳性羊处理。

（3）注意事项：启封后的剩余水解素不得继续使用。注射水解素后，健康羊不产生凝集素，病羊的凝集素不增高，所以不影响血清学检验。

5.鼻疽变态反应检验

（1）鼻疽菌素点眼试验

①点眼前准备：在进行点眼前的第1d选好马骡集中场所，作好一切准备工作。

②组织人员分工：术者1人，助手1人，记录1人，保定1～2人。

③器材准备：消毒点眼管2～3支，消毒盘1个，适量鼻疽菌素（马来因），硼酸棉球，纱布，记录本，来苏儿，工作服，口罩，眼镜，毛巾及保定用具。

（2）点眼注意事项

①拴马时必须背向太阳，在厩内时，马头需向通路。

②点眼前应详细检查眼内有无异物，结膜、角膜有无损伤。正常者方可进行点眼。点眼毕，检查颌下淋巴结、皮肤及鼻腔。均应详细记录。

③一般均点于左眼，如左眼有异常则点右眼，但必须在笼头上系1布条作为标志。

④点眼时间一般规定从早晨开始，争取在9点钟前结束。

⑤点眼试验第1次呈阴性及疑似反应者，应作第2回点眼，其间隔为5～6d。每次点眼用鼻疽菌素原液3～4滴，第2次点眼时应点入同一眼中。

⑥点眼后，马匹应拴系确实；防止风沙侵入及阳光直射；指定专人看管，防止马匹相互啃咬或摩擦眼睛。

（3）操作方法：点眼时，由助手固定马头，术者左手食指插入上眼睑窝内，使瞬膜露出，用拇指拨开下眼睑，使瞬膜和下眼睑构成凹陷，右手持吸有鼻疽菌素的点眼管保持水平方向，手掌下缘放在颌骨的眶部，点眼管尖部距凹陷约1cm，拇指按胶皮乳头，滴入鼻疽菌素3～4滴（0.2～0.3ml）。此时，马如频频瞬睫，低头砸唇，即为点眼确实，若伸颈使瞬膜露出或闭眼流泪甚多时，有时可能将鼻疽菌素排出，应立即重点1次。

（4）检查时间：应在点眼后第3h、6h、9h共检查3次，并尽可能做到在第24h再检查一次。在第6h检查时，要翻开眼睑，其余时间观察，必要时亦应翻开眼睑检查。

（5）判定标准

阳性反应（＋）：结膜发炎，肿胀明显，分泌物为脓性者。

疑似反应（±）：结膜潮红，轻度肿胀，分泌物为灰白色浆性及黏性（非脓性）者。

阴性反应（-）：点眼后无反应者，或结膜轻微充血及流泪者。

6.鼻疽菌素皮下注射试验（热反应）

（1）注射前注意事项：皮下注射前1d，被检动物必须作一般临床检查，于早、午、晚测3次体温并详细记载。体温正常者方可作皮下注射。在3次体温记录中，其中如有一次超过39℃和3次平均体温超过38.5℃，以及在前1次皮下注射后，尚未经过1个半月以上者，均不得作皮下注射。

（2）注射部位及剂量：注射部位通常在颈左侧或肩前胸部。注射前，术部先行剪毛消毒，注射量为鼻疽菌素原液1ml。

（3）注射时间：通常在夜间12点钟注射，自次日晨（即注射后第6h）开始测温，每2h测温1次，连测10次，再于第36h测温1次，将测温结果记录下来画成曲线，并记录局部肿胀程度，以备判定。

（4）注射后注意事项：注射后的牲畜在24h内不得使役，并不能饮冷水。

（5）注射后的反应：皮下注射鼻疽菌素后，马、骡、驴及骆驼均可发生体温反应及局部或全身反应。

①体温反应。鼻疽病畜经皮下注射后，至第6～8h体温开始上升，第12～16h体温升到最高峰，以后即逐渐降低，亦有于第30～36h内体温再度轻微上升。

②局部反应。注射部位发热、肿胀、疼痛，以24～36h最为显著，直径可达10～20cm，继而逐渐消散，有时肿胀持续2～3d。

③全身反应。注射后精神不振，食欲减退，呼吸急促，脉搏加快，步态踉跄，战栗，大小便次数增加，颌下淋巴结肿大等。

（6）判定标准

阳性反应：体温升到40℃以上，呈稽留热，并有轻微的局部反应，或体温稽留在39.6℃以上，并有显著的局部反应及全身反应。

疑似反应：体温虽有升高，但不超过39.6℃，且有轻度的全身反应及局部反应等，或体温一度升到40℃而不稽留并无局部反应。

阴性反应：体温在39℃以下，并无局部及全身反应者。

皮下反应法比皮内法操作繁琐，而且检出率低，反应不如皮内法敏感易判，因此较少采用。

三、免疫电镜技术

近年来，免疫学方法与电镜技术相结合，形成了一种免疫电镜技术（Immun oelectron- microscopy，IEM），使抗原定位达到了亚细胞水平。免疫电镜技术为抗原亚细胞水平定位提供了有力工具，也为病毒病快速诊断提供了一个新方法。近几年来，有些科技工作者利用不同标记物在电镜下呈现不同的形态和电子密度的特点，建立了一些双标记或多标记免疫电镜技术，可在同一反应系统中，同时观察不同抗原及受体在细胞表面和细胞结构中的定位。该项技术由以下环节组成。

（一）组织准备

用于免疫电镜检测的组织多种多样，所以各自在组织制备时都有其特点。一般讲，组织力求新鲜并进行无活力状态处理，例如树胶包埋等，避开高温（55℃～66℃），所用溶液应是中性缓冲液。

1.固定　常用的固定液有甲醛和戊二醛。使用时要注意固定试剂pH值，渗透压应调整到“生理”状态。另外四氧化锇也是一种良好的膜稳定剂。

2.固定后处理　组织长时间浸于脱水溶剂、液相树脂中时会抽走分子较小的可溶性抗原，另外超薄树脂包埋切片长时间与免疫试剂作用（如24～48h）会引起形态学的改变，而采用冰冻切片在很大程度上弥补了这一缺点。近年来，有人在后处理时对组织进行急冻，然后真空抽干，再用锇蒸气固定后，用阿拉伯树脂包埋。

（二）切片制备

冰冻超薄切片是免疫电镜技术中应用最广泛的。先将细胞或组织轻微固定后，用2.3mol/L蔗糖浸润速冻，然后进行切片。辣根过氧化物酶标记，或胶体金、铁蛋白、葡萄糖铁标记的抗体均可用于该方法的免疫染色。

1.包埋前处理技术　这一方法作为首选用于细胞表面抗原及受体的定位，亦可用于检测那些易被脱水剂及树脂成分变性的抗原。首先用切片刀将新鲜或固定的组织切成20至几百微米厚，然后用改良的间接免疫酶技术进行染色，在试剂中加入TyitonX－100增加其穿透性，用四氧化锇固定，增加DAB染色反差。最后再包埋制成切片。一般认为，在组织中切面下方2～4μm是染色较理想的部位。

2.包埋后切片技术　包括两种方法，一是用包埋好的组织切成一般切片，免疫染色后用于光镜检查，同时作系列超薄切片染色并用电镜观察，将光镜得到的结果与电镜观察结果比较，推断抗原所在部位。这一方法的缺点是不能在亚细胞水平直接定位。另一种方法将包埋后组织直接进行超薄切片染色，酶标记与胶体金标记的抗体可用这一方法。

（三）标记物选择

1.辣根过氧化物酶　是最常用的一种标记物，性质稳定，分子量小，易穿透组织，在标记过程几乎不受损。其底物为3，3’－二氨基联苯胺，可通过锇化或氯化钴作用增加其电子密度。

2.铁蛋白及葡聚糖铁颗粒　首先用免疫电镜标记的是马脾脏铁蛋白。应用双功试剂（如间位苯二甲基二异氰酸m－Xylylene diisocynste）可将铁蛋白偶联于抗体球蛋白分子上，因铁蛋白分子量大不易穿透，故常采用冰冻超薄切片技术和包埋前处理切片技术。葡聚糖铁颗粒用于免疫标记时可采用上述方法。

3.放射性标记　该方法已有人应用，采用内标记法将同位素标记到抗体球蛋白分子上。

4.重金属　应用不广泛。用胶体金、水银、铁、铀标记抗体等。铀离子能非特异性的结合在整个抗体分子上。因此需先将抗原与抗体结合，再将抗原与抗体分开，除去抗原成分，即得到未失去免疫活性的铀标记抗体。胶体金能吸附于免疫球蛋白上，吸附的抗体以30000r/min离心沉淀，胶体金标记抗体可保存6个月（5℃），不耐冻结。

5.血蓝蛋白　无脊椎动物的血蓝蛋白形态规则，在电镜下容易辨认，可从鲎、角螺、文蛤等的血淋巴液中提取，其分子量达900万，可用ConA、戊二醛将抗体球蛋白分子联结于血蓝蛋白上。

（四）免疫电镜技术操作方法

标记抗体染色程序可根据不同需要，进行直接法、间接法、杂交抗体等方法，就像酶标记抗体一样。下面介绍几种常见的免疫电镜操作程序。

1.病毒的电镜凝结试验　近年来由于电镜技术的发展，病毒的电镜凝结已被用做常规的检验手段。用于电镜检查的病毒悬液需先经适当的提纯和浓缩。细胞培养中的病毒经冻融裂解后，差速离心使病毒沉淀，将沉淀的病毒悬于适量生理盐水中，取一滴病毒悬液和一滴抗血清，混合后4℃过夜，然后再加一滴3%磷钨酸负染，滴于被有炭膜的铜网上，吸干，即可作电镜检查。可见病毒颗粒凝结成团，并见有抗体分子的晕，病毒颗粒之间保持着一定距离。在最佳透射条件下，可看到单独的、近球形的抗体分子，有时在病毒颗粒之间连成桥。检查时，要注意与自然形成的病毒团相区别，必须设未加血清的对照。电镜凝结试验可进行病毒的确切鉴定。

2.冰冻超薄切片的免疫染色　将组织用甲醛或戊二醛固定，切成0.5mm³大小，置0.6～2.3mol/L蔗糖溶液渗透，然后速冻（液氮等），超薄切片，展于用炭膜包被后的铜网上，切片面向下置于含0.3%琼脂和1%明胶的湿盘上，通过渗透作用除去蔗糖，再用含0.01～0.2mol/L甘氨酸的PBS（PBS－g）漂浮铜网，然后在铜网上滴加含2%明胶PBS，放置10min，再按下列步骤进行。

（1）PBS－g液中置10min后，PBS漂洗。

（2）采用工作浓度的抗血清孵育，稀释液中常加明胶或白蛋白（0.4W.V），孵育的温度与时间都需要试验比较得出。

（3）PBS漂洗。

（4）胶体金标记二抗（工作浓度、作用时间和温度均需进行测定）作用后，PBS漂洗。

（5）置于含2%戊二醛水溶液中5min，水漂洗，晾干后电镜观察。注意同时设置阴性、阳性对照。

3.辣根过氧化物酶－抗辣根过氧化物酶（peroxidaseantiperoxidase，PAP）组化法这一方法主要用于包埋前切片技术。首先将组织用含4%甲醛和0.2%戊二醛的0.1mol／L磷酸盐缓冲液（pH7.4）浸泡固定2～4h（4℃），再用2.3mol/L蔗糖溶液渗透6～8h，液氮速冻后放在2.3mol/L蔗糖溶液中解冻，然后转移到PBS中。这一速冻和解冻过程主要是为了不影响超微结构的前提下冻破细胞以利于标记物及免疫试剂的顺利穿透。步骤如下。

（1）用Vibratome将组织切成20～50μm厚的薄片。

（2）10%正常血清（如羊或猪血清）作用30～60min，PBS漂洗。

（3）加一抗（羊抗兔血清1∶10～1∶100）作用1h，PBS洗。

（4）加二抗（羊兔血清）作用过夜。

（5）与辣根过氧化物酶－兔抗辣根过氧化物酶复合物（PAP）（1∶50）作用1.5～2h，PBS洗。

（6）置于含0.06% DNA、0.01% H₂O₂的0.05mol/L Tris－HCIpH7.6溶液中10min，然后浸入PBS溶液中终止反应。

（7）用1%四氧化锇作用2h，PBS漂洗。

（8）脱水进行树脂包埋，制电镜超薄切片后观察。