核酸扩增技术

第三节　核酸扩增技术

核酸扩增包括聚合酶链反应、连接酶链反应和Qβ复制酶技术等。下面分别叙述。

一、聚合酶链反应

聚合酶链反应（Polymerase chain reaction，PCR）由美国Centus公司的Ksry Mullis发明，于1985年由Saiki等在《Science》杂志上首次报道，是近年来开发的体外快速扩增DNA的技术。通过PCR可以简便、快速地从微量生物材料中以体外扩增的方式获得大量特定的核酸，并且有很高的灵敏度和特异性，可在动物检疫诊断中用于微量样品的检测，另外也可与血清学（如ELISA）结合应用。

（一）PCR的基本原理和过程

PCR技术是在模板DNA、引物和4种脱氧单核苷酸存在的条件下，依赖于耐高温的DNA聚合酶的酶促合成反应。PCR以欲扩增的DNA作为模板，以和模板正常和负链末端互补的两种寡核苷酸作为引物，经过模板DNA变性、模板引物复性结合、并在DNA聚合酶作用下发生引物链延伸反应来合成新的模板DNA。模板DNA变性、引物结合（退火）、引物延伸合成DNA构成一个PCR循环。每一循环的DNA产物经变性又成为下一个循环的模板DNA。这样，目的DNA数量将以2n～2ⁿ形式累积，在2h内可扩增30（n）个循环，DNA量达原来的上百万倍。PCR三步反应中，变性反应在高温中进行，目的是通过加热使DNA双链解离形成单链；第二步反应又称退火反应，在较低温度中进行，它使引物与模板上互补的序列形成杂交链而结合上模板；第三步为延伸反应，是在4种dNTP底物Mg^2＋存在的条件下，由DNA聚合酶催化以引物为起始点的DNA链延伸反应。通过高温变性、低温退火和中温延伸3个温度的循环，模板上介于两个引物之间的片段不断得到扩增。对扩增产物可通过凝胶电泳、Southern杂交或DNA序列分析进行检测。

（二）PCR反应条件和反应系统的组成

1.反应条件P　CR反应通过三种温度的交替循环来进行，一般94℃变性30s，55℃退火30s，70℃～72℃延伸30～60s，依此条件进行30次左右的循环。

2.PCR反应系统的组成　标准的PCR反应体系一般选用50～100μl体积，其中含有：50mmol/L KCl，10mmol/l Tris.HCl（室温，pH8.3），1.5mmol/L MgCl₂明胶或牛血清白蛋白（BSA），2种引物，各0.25μmol/L，4种脱氧核糖核苷酸底物（dATP，dCTP，dGTP，dTTP）各200μl，模板DNA0.1μg；TaqDNA聚合酶2.5IU。

（三）PCR基本操作

一个典型的PCR反应可按以下步骤进行。

1.将下列成分依序加入0.5ml灭菌离心管中并混匀。

2.置94℃加热5min。

3.将0.5μl TapDNA聚合酶（5IU/μl）加入反应混合液中。

4.将100μl轻矿物油加入混合液表面，以防水分蒸发。

5.按所设定的反应条件进行循环反应（在PCR仪上进行）

6.反应终止后，取样品进行凝胶电泳，Southern杂交或DNA序列分析以鉴定是否得到特异的扩增产物。

（四）PCR衍生技术

PCR可扩增双链DNA和单链DNA，并能以RNA为模板，进行反转录PCR（RT－PCR）以扩增cDNA。经不断发展和完善，已有多种衍生PCR技术。除反转录PCR外，尚有不对称PCR、反向PCR、锚定PCR、多重PCR、着色互补PCR、免疫PCR和套式PCR等。

1.反转录PCR（reverse transcription PCR，PT－PCR）　RT－PCR用于扩增RNA样品。在PCR体系中先引入反转录酶，将RNA反转录获得cDNA，再以cDNA作为PCR的模板，加入引物和TapDNA聚合酶按正常PCR方式扩增cDNA。这一技术广泛应用于RNA扩增和RNA病毒的检测。

2.锚定PCR（Anchored PCR）　通常进行的PCR试验必须知道欲扩增DNA或RNA片段两侧的序列，并以此为依据设计引物进行PCR。当欲扩增的片段序列未知时，可通过锚定PCR进行扩增。其基本方法是分离细胞总RNA或mRNA并经反转录合成cDNA，通过DNA末端转移酶在cDNA3’端加上同源多聚物（poly dG）尾，通过与其与互补的锚定引物（poly dC）来保证扩增反应的特异性。

3.反向PCR（Inverse PCR）　常规PCR是扩增两个已知序列之间的DNA片段，反向PCR则用于扩增位于已知序列的两侧的一段未知序列。方法是使含已知序列和未知序列的DNA片段环化，再用限制性内切酶切开已知序列，这样线性化的原位于已知序列两侧的未知序列变为位于已知序列之间，再经常规PCR操作就可大量扩增未知序列。

4.不对称PCR（Asymmetric PCR）　不对称PCR又称单链扩增PCR。一般PCR反应中两种引物的量是相等的，不对称PCR中，两种引物的量相差悬殊，一般为50∶1～100∶1，这样在生成一定数量的双链产物后，较少的引物就会被用完，大量生成一条单链的DNA，分离单链即可直接进行序列分析等研究。

5.多重PCR（Multiplex PCR）　应用PCR技术可检测特定序列的存在或缺失。某些疾病的基因片段较大，且常有多处发生缺失或突变。用一对引物进行PCR检测时，扩增不到目的片段，此时就须使用多重PCR技术。在同一反应管中加入多对引物，扩增同一模板的多个片段，如果某一片段缺失，或扩增该片段的引物与被检核酸同源性太低，则在相应的电泳图谱上就无相应的正常片段出现，但可保证其他特异片段出现。目前报道的多重PCR反应，最多可同时扩增12条区带。当然，也可设计两对引物，分两次进行常规PCR。

6.着色互补PCR（Colour complementation assay）　着色互补PCR又称荧光PCR（F1uroscent PCR）。其原理是用不同的荧光染料分别标记不同的寡核苷酸引物，通过多重PCR同时扩增多个DNA片段。反应结束后除去多余引物，扩增产物在紫外线照射下能显示某一种或几种荧光染料颜色的组合，如果某一DNA区带缺失，则会缺乏相应的颜色。通过颜色的有无及其组合可很快诊断基因的缺失、有变异或发现某些感染的病毒基因等。这一技术为PCR技术的临诊自动化诊断打下了基础。

7.免疫PCR　免疫PCR即免疫多聚酶链反应（Immuno－PCR）。它是将高度灵敏的PCR技术与特异的免疫学方法相结合的一种新型的诊断技术，是目前最有希望的诊断方法。它的原理是通过DNA和抗体具有双重结合活性的连接分子使二者连接起来，这样就可以使作为指示系统DNA分子通过抗体而特异性地结合到抗原上，从而形成一种特异性“抗原－抗体－DNA复合物”，再通过对其中已知片段DNA的PCR扩增，即可证明抗原存在与否。这种方法的特点在于：①通过免疫捕获作用纯化检测对象；②用于检测的微生物无需事先明确其核酸序列；③该方法也适用于微生物以外的抗原检测，其前提条件是被检测对象具有良好的抗原性，并且备有其相对应的抗体；④无需根据不同对象设计不同的引物。被连接的已知片段DNA相当于指示剂，无论检测对象是什么，只需合成针对这段DNA的引物即可；⑤省去了普通PCR实验检测RNA病毒的反转录过程，既增加了灵敏度又降低了实验成本。这项技术的发明者Sano，T.（1992）等的试验表明，免疫PCR的灵敏度比ELISA方法高10万倍，足以检测出单个抗原分子。

8.套式PCR（Nested PCR）　普通PCR的产物DNA往往需要再扩增，以便对之进行进一步鉴定、分子克隆或用作其他用途。此时，由于DNA产物的末端效应，用原来的那对引物难以实现再扩增的目的。如果在原来的引物内侧重新设计一对引物，再进行新一轮PCR反应。这种采用多对成套引物，逐步扩增DNA内侧片段的PCR就称为套式PCR。目前很多分子生物学实验室为了各自的研究需要都在应用这一技术。

（五）POR技术用途

1.传染病的早期诊断和不完整病原检疫　在早期诊断和不完整病原检疫方面，应用常规技术难以得到确切结果，甚至漏检，而用PCR技术可使未形成病毒颗粒的DNA或RNA或样品中病原体破坏后残留核酸分子迅速扩增而测定，且只需提取微量DNA分子就可以得出结果。

2.快速、准确、安全检测病原体　用PCR技术不需经过分离培养和富集病原体，一个PCR反应一般只需几十分钟至2h就可完成。从样品处理到产物检测，一天之内可得出结果。由于PCR对检测的核酸有扩增作用，理论上即使仅有一个分子的模板，也可进行特异性扩增，故特异性和灵敏度都很高，远远超过常规的检测技术，包括核酸杂交技术。PCR可检出fg水平的DNA，而杂交技术一般在Pg水平。PCR技术适用于检测慢性感染、隐性感染，对于难以培养的病毒的检测尤其适用。由于PCR操作的每一步都不需活的病原体，不会造成病原体逃逸，在传染病防疫意义上是安全的。

3.制备探针和标记探针　PCR可为核酸杂交提供探针和标记探针。方法是：①用PCR直接扩增某特异的核酸片段，经分离提取后用同位素或非同位素标记制得探针；②在反应液中加入标记的dNTP，经PCR将标记物掺入到新合成的DNA链中，从而制得放射性和非放射性标记探针。

4.在病原体分类和鉴别中的应用用　PCR技术可准确鉴别某些比较近似的病原体，如蓝舌病毒与禽流感病毒。PCR结合其他核酸分析技术，在精确区分病毒不同型、不同株、不同分离物的相关性方面具有独特的优势，可从分子水平上区分不同的毒株并解释它们之间的差异，如新近建立的禽流感RT－PCR分子诊断技术。

此外，PCR技术还广泛应用于分子克隆、基因突变、核酸序列分析、肿瘤基因和抗癌基因以及抗病毒药物等研究中。

（六）PCR技术应用概况

从诞生至今约10年的时间里，PCR技术已在生物研究领域得到广泛的应用。将PCR技术用于动物传染病的检疫诊断研究也日趋广泛。例如，新西兰农渔部质量管理机构所属动物健康实验室（AHLS）负责对各种外来疾病的疫情监测诊断，该室在1992年建立了几项PCR检测技术，包括从结核病病灶中快速检测牛分支杆菌；快速检测患病牛羊中副结核分支杆菌；检测恶性卡他热和新城疫等。

自1990年始，将PCR应用于动物传染病的诊断等研究的报道，可归纳如下。

1.快速诊断各类病毒病　用PCR成功进行检测的动物传染病病毒有：蓝舌病病毒、口蹄疫病毒、牛病毒性腹泻病毒、牛白血病病毒、马鼻肺炎病毒、恶性卡他热病毒、伪狂犬病病毒、狂犬病病毒、非洲猪瘟病毒、禽流感病毒、禽传染性支气管炎病毒、禽传染性喉气管炎病毒、马传染性肺炎病毒、马立克氏病毒、牛冠状病毒、鱼传染性造血器官坏死病病毒、轮状病毒、鱼病病毒、水貂阿留申病病毒、山羊关节-脑炎病毒、梅迪-维斯纳病毒、猪细小病毒等。

2.由其他病原体引起的传染性疾病的研究　目前已报道的有致病性大肠杆菌毒素基因、牛分支杆菌、炭疽杆菌芽孢、钩端螺旋体、牛巴斯虫和弓形虫等的PCR检测研究。在仪器微生物的检测中，PCR技术的应用也日益广泛。Hornes等（1991）采用一种固相比色PCR技术成功检测了大肠杆菌热稳定肠毒素（STs）IS（STIa）和Ib（STIb）基因。

二、连接酶链反应

在连接酶的下两段寡核苷酸能通过形成磷酸二酯键而连接形成较长的核酸片段。连接酶链反应（Ligase chain reaction，LCR）技术基于如下原理：在65℃，由于热稳定连接酶的作用，两段与模板正确杂交的寡核苷酸能连接形成新的较长的核酸片段。通过高温变性、适温退火和连接三步一循环的反应，新形成的靶核酸片段成为下一循环的模板而使反应延续，这样，扩增产物将像PCR一样呈指数递增。

LCR反应体系需采用4个寡聚核苷酸引物，其中两个与模板正链结合，另两个与负链相结合。引物长15～20bp，故LCR扩增产物长30～40bp。由于扩增产物较短，循环反应中的变性温度一般应比常规PCR要低。

热稳定连接酶分离自嗜热细菌，它能精确识别与模板正确杂交的寡核苷酸引物。由于碱基误配而杂交上模板非特异引物将不能起连接反应。与PCR相比较，LCR中非特异性扩增产物产生的几率很低，有资料表明，经过50～70个LCR循环，非特异性扩增产物未有明显增长，这样，可保证反应的高度敏感性和特异性。

LCR已应用于检测人乳头瘤病毒、结核分支杆菌等病原体。目前，LCR的应用范围远不如PCR广泛，但LCR与PCR相结合，可有效解决分子生物学研究领域的一些问题，如启动子等小片断核酸的克隆等。

三、Qβ复制酶技术

Qβ复制酶是Qβ噬菌体产生的一种依赖于RNA的RNA聚合酶。该酶于1963年由Haruna和Weissmann等人发现并命名。Qβ复制酶能以某些单链RNA为模板，在体外大量复制单链RNA。该酶有严格的模板特异性，能在体外充当Qβ复制酶模板的所有RNA分子均含大量的二级结构，且模板和产物RNA必须能在复制过程中形成稳定的分子内二级结构。

Lizardi等（1988）发现，在Qβ复制酶的天然模板MDV－1 RNA中插入一段疟原虫（plasmodium falciparum）的特异序列后，所形成的重组PNA片段仍可作为模板被Qβ复制酶大量扩增。经37℃反应半小时，可在模板最低的反应体系（约含1000个分子）检测到129ng的重组RNA分子，相当于1亿倍扩增。Qβ复制酶能扩增经过修饰的RNA片段，因此可应用于诊断和检测单链RNA或DNA序列。

据1992年发表的有关资料介绍，Gene Trak Systems的科研工作者已在用Qβ复制酶开发传染病诊断的技术。其技术要点如下：先用异硫酸氰胍处理生物材料（如血、尿、脑脊髓液），使RNA释放出来。由于Qβ复制酶通常不复制欲扩增的特异RNA序列，如HIV－1 RNA；因此，待检材料须再做如下处理，先用一捕获探针（捕获探针与一种磁性小球偶联）通过杂交反应将HIV－1 RNA“钓”出来，随后洗脱其他未结合的RNA分子；将其哺育，重复洗涤除去未与复合体结合的重组MDV－1 RNA，最后加入Qβ复制酶进行扩增反应。Qβ复制酶将只扩增与捕获探针和HIV－1 RNA所形成的复合体结合的重组MDV－1 RNA。30min可扩增10⁶～10⁷倍。

这一技术不直接扩增检测的特异的序列，而通过扩增与欲检测RNA分子相结合，这样虽增加了处理步骤，但可大大减少非特异性扩增产物。

Qβ复制酶技术尚待完善，但作为一项核酸扩增技术，亦具备可观的应用潜力。