保存和观察方法

第二节　蠕虫标本的采集、保存和观察方法

一、吸虫的采集保存

（一）采集

在各脏器中或其冲洗物沉淀中，如发现吸虫时，应以弯头解剖针或毛笔将虫体挑出（注意！不应采用镊子夹取，否则镊子夹住的部位，会使虫体损坏变形，影响以后的观察）。挑出的虫体，体表常附有粪渣、黏膜等污物，应先放入1%的盐水溶液中。较小的虫体，可和盐水放入小试管中，加塞塞紧，充分振荡将污物除去洗净。较大的虫体可用毛笔刷洗。有些虫体的肠管内含有大量的食物，可在生理盐水中放置过夜，等其食物消化或排出。

（二）固定法

标本洗净后，较小的虫体，可先在薄荷脑溶液中使虫体松弛。薄荷脑溶液的配制是取薄荷脑（Mentho1）24g，溶于100ml95%的酒精中，为薄荷脑饱和酒精溶液，使用时将此液一滴，加入100ml水中即可。

在上液中松弛的虫体，即可投入下述固定液中固定。较大较厚的虫体标本，为了以后制作压片标本的方便，可将虫体先压入两载玻片间，为了不使虫体压得过薄可在玻片两端垫以适当厚度的纸片，尔后以橡皮筋扎紧玻片两端。

固定吸虫时常用的固定液有如下几种。

1.劳氏（Looss）固定液　适用于小型吸虫。取饱和升汞溶液（约含升汞7%）100ml，加冰醋酸2ml，混合即成。固定虫体时，将虫体放于一小试管中，加入盐水，达试管的1/2处，充分摇洗，再加入劳氏固定液摇匀，12h后，将虫体取出移入加有0.5%碘的70%的酒精中，并更换溶液数次，直到碘酒精溶液不再褪色为止，再将虫体移到70%酒精溶液中保存，若欲长期保存应在酒精中加5%甘油。

2.酒精－福尔马林－醋酸固定液（A.F.A固定液）　本液以95%酒精50份，福尔马林（实含甲醛40%）10份，醋酸2份，水40份混合而成。大型的已夹于玻片间的虫体，可浸入此固定液中过夜。小的虫体可先放于充满2/3生理盐水的小瓶内，用力摇振，待虫体疲倦而伸展时，再将盐水倾去1/2，再加入本固定液，放置过夜。次日将虫体取出，保存于加有5%甘油的70%酒精中。

3.福尔马林固定液　取福尔马林1份与水9份混合即得。将小型吸虫虫体或夹于玻片间的虫体投入固定液中，经24h即固定完毕。较大的夹于两玻片间的吸虫，固定液渗入较难，可在固定数小时后，将两玻片分开，这时虫体将贴附于一玻片上，将附有虫体的玻片继续投入固定液中过夜。最后将虫体置3%～5%的福尔马林溶液中保存。

经以上三种方法中任何一种固定的标本，在保存时均应给以标签。标签应用较硬的纸片（如道林纸）用铅笔书写，内容应包括标本编号、采集地点、宿主及其产地、寄生部位、虫名、保存液种类和采集时间，将以上内容一式两份书写，一份与虫体一同放于瓶内，一份贴于瓶外。

在采集标本时，尚应有登记本，将标本采集时的有关情况，按标本编号，记于登记本上。对虫体所引起的宿主的病理变化也应做详细的记载。

（三）装片标本制法

吸虫标本的形态观察，常需制成染色装片标本或切片标本。切片标本的制作与组织切片相同。整体装片标本的制法有以下数种。

1.苏木素法　常用的为德氏（Delafield）苏木素染液。其配法如下：先将苏木素4g溶于95%酒精25ml中，再向其中加入400ml的饱和铵明矾（Ammonium Alum）溶液（约含铵明矾11%）。将此混合液曝晒于日光及空气中3～7d（或更长时间），待其充分氧化成熟，再加入甘油100ml和甲醇100ml保存，待其颜色充分变暗后，滤纸过滤，装于密闭的瓶中备用。染色时步骤如下。

（1）将保存于福尔马林中的虫体，取出以流水冲洗。如虫体原保存于70%酒精中，则先后将虫体移经50%和30%酒精中各1h，再移入蒸馏水中。

（2）将德氏苏木素染液加蒸馏水10～15倍，使呈浓葡萄酒色。将以上虫体移入此稀释的染液内，染色过夜。

（3）取出染色后的虫体，在蒸馏水中除去多余的染液，再依次通过30%，50%，70%酒精各0.5～1h。

（4）虫体移入酸酒精中褪色（酸酒精是在80%酒精100ml中加入盐酸2ml），待虫体变成淡红色。

（5）再将虫体移回80%酒精中，再循序通过90%，95%和l00%酒精中各0.5～1h。

（6）将虫体由100%的酒精中移入二甲苯或水杨酸甲酯（亦称冬绿油或冬青油）中，透明0.5～lh。

（7）将透明的虫体放于载玻片上，滴一滴加拿大树胶，加盖玻片封固，待干，即成。

2.卡红染色法　以卡红为原料，常用的染色液有盐酸卡红和硼砂卡红等。

盐酸卡红的配制是以蒸馏水15ml加盐酸2ml，煮沸，趁热加入卡红染粉4g，再加入85%的酒精95ml，再滴加浓氨水以中和，等出现沉淀，放凉，过滤，滤液即为盐酸卡红染液。

硼砂卡红是以4%硼砂（Na₂B₄O₇）溶液100ml，加入卡红染粉1g，加热使其溶解，再加入70%酒精100ml，过滤，滤液即为硼砂卡红染液。

染色方法如下。

（1）原保存于70%酒精内的标本，可直接取出投入染色液中染色。保存于福尔马林液内的虫体标本，应先取出水洗1～2h，尔后循序通过30%，50%，70%的酒精各0.5～lh，再投入染液中，在染液中过夜使虫体染成深红色。

（2）自染液中取出虫体，放入酸酒精中褪色，（酸酒精是以70%酒精100ml加浓盐酸2m1），使颜色深浅分明，即虫体外层呈淡红色，内部构造呈深红色。

（3）虫体移入80%、95%和纯酒精中各0.5～1h。

（4）移入二甲苯或水杨酸甲酯中透明。

（5）已透明的虫体，移置载玻片上，加一滴加拿大树胶，加盖玻片封固。

二、绦虫的采集保存

1.采集　绦虫大部分寄生于肠管中，并以头节牢固地附着于肠壁上。采集标本时，为了保证虫体的完整，切勿用力猛拉，而应将附着有虫体的肠段剪下，连同虫体浸入水中，5～6h后，虫体会自行脱落，体节也自行伸直。

2.固定　将收集到的虫体，浸入劳氏固定液、70%酒精或5%福尔马林液中固定。准备做瓶装陈列的标本，以福尔马林溶液固定较好。如欲制成染色装片标本以观察其内部结构，则以劳氏固定液或酒精固定为好。

绦虫有时很长（可达数米），易于断裂而又易于相互缠结，故固定时应注意。不太长的虫体，可提住虫体后端，将虫体悬空伸长，尔后将虫体下放，逐步地浸入固定液内。过长的虫体，可先绕于一玻璃瓶上，连瓶浸入固定液内。亦可在大烧杯中，先放入以固定液浸润的滤纸一张，提取虫体后端，使虫体由头节始，逐步放落在滤纸上，加盖一层湿滤纸；再以同样操作，放上第2条虫体；如是操作，全部放好所有虫体，最后将固定液轻轻注满烧杯内，固定24h后取出。

保存于瓶内的标本应登记并加标签，其注意事项同吸虫。

3.绦虫制片法　绦虫虫体较长，因此，制片时要切断虫体，根据观察的需要，采取一定部位的节片，染色后做成装片标本。绦虫的头节是决定绦虫种类的重要依据之一，应选为装片标本的材料；此外，成熟节片和孕卵节片，亦常各切取3～5节，制成染色装片标本。其染色和装片方法与吸虫同，可参阅吸虫的有关资料。

三、线虫的采集保存

1.采集　在剖检家畜时，按上节寻找虫体的方法，发现虫体后，以弯头解剖针或毛笔将虫体挑出，移入生理盐水中，洗净；寄生于肺部的线虫和丝虫目的线虫，在略为洗净后即应尽快地放于固定液中固定，否则虫体易于破裂。

线虫雌雄异体，雌虫一般较雄虫大，在虫体鉴定时，常需依雄虫的某些形态特征作为依据，因此，采集虫体时不可忽视较小虫体的采集。一些有较大口囊的线虫（如圆线虫、夏伯特线虫、钩口线虫等）和有发达交合伞的线虫，其口囊或交合伞中，常包含有大量杂质，妨碍以后的观察，应在固定前用毛笔洗去，或充分振荡以洗去，尔后固定。

2.固定　可采用酒精或福尔马林固定。用酒精固定时，系用70%酒精，加热到70℃左右（在火焰上加热时，酒精中有小气泡升起时即约为70℃），将洗净的虫体移入，虫体即在热固定液中伸直而固定，待酒精冷后，将虫体移入含5%甘油的80%酒精中，加标签保存。标签的书写内容与吸虫同。

福尔马林固定液是福尔马林3ml加到生理盐水100ml中。固定虫体时也应先将固定液加热到70℃，再投入虫体。固定后标本即保存于固定液内，也可以移入含5%甘油的80%酒精中，加标签保存。

（1）线虫的观察与制片：线虫经固定后，是不透明的，欲进行线虫形态的观察，必先进行透明或装片。为了能从不同的侧面对虫体形态进行观察，以不做固定装片为好，这样可以在载玻片上将虫体翻动，观察得更仔细。

（2）虫体的透明方法，常用的有以下各种。

①甘油透明法：将保存于含5%甘油的80%酒精中的虫体，连同保存液倾入蒸发皿中，置温箱中，并不断滴加少量甘油，直到酒精蒸发殆尽，此时留于残存甘油中的虫体即已透明，可供检查。

如欲在短时间内完成这一透明过程，可将蒸发皿放于一加有热水的烧杯上，以酒精灯加热，促使蒸发皿中的酒精在短时间内挥发，而达到虫体透明的目的。

此法透明后的标本，即可保存于甘油内。

②乳酚（Lacto－pheno1）法：乳酚系由甘油2份，乳酸1份，石炭酸1份和蒸馏水1份混合而成，是一种良好的透明液。虫体自保存液中取出后，应先移入乳酚液与水的等量混合液中，半小时后再移入乳酚液中，数分钟后，虫体即透明，可供检查。检查后虫体应自透明液中取出，移回原保存液中保存。

③石炭酸透明法：虫体自保存液中取出，放于纯石炭酸溶液中（石炭酸原为针状结晶，纯溶液指含水10%的溶液），虫体很快即透明。若透明过度，可于检查时，在盖玻片边缘处（盖玻片下是浸在石炭酸中的虫体）滴加无水酒精一滴，此法透明快。透明液对人有腐蚀性，对虫体也有损害，故观察后应立即将虫体移回原保存液中，并在短期内更换保存液3次，以除去残留的石炭酸，否则虫体将变为棕褐色。

有时为了某种需要，亦可将线虫制成装片标本。制作时虫体不染色，直接循序通过70%，80%，90%，100%的酒精各0.5h脱水，最后在水杨酸甲酯或二甲苯中透明，透明后移载玻片上，滴加拿大树胶，拨正所需位置，加盖玻片封固。

如在虫体脱水前，按吸虫制片的方法，将虫体先以苏木素或卡红染色，尔后制成装片标本，则效果更好。

四、蠕虫卵的采集保存

1.虫卵材料的采集

（1）自患畜粪便中收集虫卵：可参照蠕虫卵的各种集卵法。自家畜粪便中收集虫卵的缺点在于多数家畜体内常有多种寄生虫同时寄生，不易获得单一种的虫卵。

（2）生理盐水收集虫卵：将解剖家畜时所采集的每种寄生虫挑入生理盐水中，此时虫体尚未死亡，常可在盐水中继续产出一部分虫卵，尔后将虫体取出，将此盐水静置沉淀，待虫卵集中于底部后收集之。

本法所得虫卵，因为未经肠道与粪便混合，所以是无色的，与粪便中所见虫卵，在颜色上有所不同，为此可将取得的虫卵混入粪便中，存放数天，使之染色。

2.虫卵标本的保存　将虫卵保存于瓶内。将含有虫卵的沉淀倾入一小烧杯中，加入已加热到70℃～80℃的巴氏液，等冷后，保存于小口试剂瓶中，用时吸取沉淀，放于玻片上检查。巴氏液是用福尔马林30ml，氯化钠7.5g，水1000ml混合而成。在以上操作中，保存液的加热很重要，否则有些虫卵在保存液中，仍然存活并继续发育或变形。虫卵保存福尔马林液中时间不宜太久，一般不超过5年，否则往往使卵壳损坏剥离影响虫卵鉴定。用下液固定，保存时间可得到延长。

福尔马林10ml，95%酒精30ml，甘油4ml，蒸馏水56ml。