病料的采集

第二节　病料的采集

与普通病不同，绝大多数畜禽传染病很难单凭其症状和病理变化作出确诊，而须依赖对病料的病原分离、鉴定和免疫学诊断等实验室检查。实验室检查结果的正确与否，在很大程度上取决于病料采集是否合理，保存是否得法和送检是否及时。可以说，病料的采集是病原学诊断的基础，所以在采集病料时，要根据现场检疫结果，针对可疑检疫对象病原存在的部位，用正确的方法采集适宜的病料送检。这是一项非常重要的工作，应予高度重视。

一、采集病料应注意的事项

（一）准备充分

平时应准备好采样所需试管、器皿、刀剪、纱布、拭子以及其他所需器械等，并消毒灭菌备用，采样用刀、剪要锋利。还应准备足够的消毒用品如酒精棉、消毒药和固定液等。

（二）操作得当

采样时切割要迅速准确，切忌拉锯式来回切割，尽量减少人为因素引起的变化。

（三）合理取材

取材目的要明确，应根据不同的检疫对象和检验目的采取适宜的检验病料，或根据临诊症状和病理变化有所侧重，少走弯路。若暂时难以确定是何种传染病，应全面取材。

（四）准确取材

不同疫病的病原在机体内的分布状况是不同的，有的以病变部位为多（如口蹄疫时病毒含量最多的是水泡皮、水泡液），有的以血液中含量最多，有的则以内脏器官含量为多。即使同一种疫病，在疫病的不同阶段和不同病型中，病原在体内的分布也不尽相同，如有的热性疫病以高热期时血液中的含量最多，体温下降后血液中的病原含量也显著下降。如果是不同病原混合感染，病原在体内的分布就更为复杂。所以，采集病料前应对各种病原在感染动物体内及其分泌物或排泄物中的分布情况有所了解，根据不同疾病以及疫病之不同阶段采集最适宜的病料。

（五）典型取材

发病动物较多时，应选择其中症状和病变均典型、未经治疗的病例采集病料。小动物（如兔子）、幼畜（如仔猪、羔羊）、家禽等可选取有代表性的完整个体送检。

（六）适时取材

活体取材最好在疾病急性发作期或发热期进行，因为此时患病动物体内病原微生物数量最多，毒力最强。供病毒分离的病料应尽可能在发病初期、急性期或发热期采集，因为此时病畜血液或病变组织内的病毒浓度很高，之后病毒会很快从血液中消失，组织内病毒滴度也会因抗体产生而迅速下降。死后应立即剖检取材，夏季气温较高时，病料采集更应及时，以防组织变性或腐败而影响检验效果。

（七）无菌取材

为了减少污染机会，保证检验结果的准确性，病理剖检时应先采取微生物学检查的病料，后检查尸体病理变化。除胃肠内容物外，其他病料必须以无菌手续采取。所用器械、物品事先必须消毒灭菌。取材时，每采一种病料应换用一套灭菌器械，如器械不足，可在采完一种病料之后，用酒精棉擦净器械，蘸取95％酒精，点燃烧灼灭菌，待冷却后，再取其他病料。采集的病料必须存放于灭菌容器内。

（八）正确处理

为了防止病料受到污染或发生变质，或者为了适应不同的检验需要，一般要对采集的病料进行简单处理。如果检验项目较多或感染的病原较复杂，每种病料应多采几份，并按不同检验项目进行相应的处理。如对血液进行分析检查的，采集的血液应进行抗凝处理；如果既要用于血液检查分析，又要进行血清学诊断，则需采集几份血样，其中一部分需经抗凝处理，另一部分则不能加抗凝剂，而使其自然凝固析出血清；如果是细菌和病毒混合感染的，每种病料应采集两份，一份按细菌学检查的要求处理（如不可以加抗菌素）、另一份按病毒学检查的要求处理（如可以加抗菌素，但不可以加对病毒活力有影响的物质），如此等等。

（九）做好标记

采集的病料应分门别类盛放于不同容器内。供微生物检验的病料应每一材料装一容器，切忌不同病料混装，以防互相污染。所有盛放病料的容器都应贴上标签，注明畜别、病料名称、采集日期和病料编号，同时做好采样登记。

（十）密封保藏

采集好的病料应立即加盖并用蜡或胶带密封，袋装病料必须扎紧袋口，防止受到污染和病原扩散。送检材料经妥善包装后，在低温条件下（如置于冰壶内）迅速送交有关实验室检查。不能及时送检的病料必须置于冰箱内冻结（不能冻结的病料除外，如血液、乳汁）或4℃冷藏保存，但也不宜久置。对于实质脏器的病料，如果送检时间超过一定限度（夏季20hs，冬季48hs），则须用化学药品保存：供细菌检查的，置于灭菌液态石蜡或30％甘油生理盐水中保存；供病毒检查的，置于50％甘油生理盐水中保存；供病理组织学检查的，置于10％甲醛溶液中保存。

（十一）注意安全

在采集病料的过程中要注意自我防护，特别是采取人畜共患病或危害严重的畜禽疫病之病料时。此外还要防止病原污染外界环境，造成疫原扩散。对那些不允许剖检的尸体（如炭疽），取材时更应小心谨慎。

（十二）认真消毒

解剖和采集病料结束后，应对剖检的尸体、废弃的组织器官等进行消毒、深埋处理。解剖和采集病料所用器械以及工作服、靴子、手套和场地、可能被污染的物品、用具等都要进行认真消毒或销毁。

二、不同病料的采集和保存

采集病料的目的是为了给病原学检查和病理组织学检查提供检验材料，以便最后对疫病做出准确的诊断。而病原包括细菌、病毒、寄生虫等，每一类病原或同一种病原的不同检查方法，对病料的要求都不同。必须按照每类病原或每种检查方法对病料的要求采集和处理病料，才能保证各项检查结果的准确性。

（一）活体病料的采集和保存

1.血液的采集和保存　采集患病动物发热期或症状明显期的静脉血液，采血部位马、牛、羊为颈静脉，猪为耳静脉或前腔静脉，禽为翅静脉。进行血液常规分析、检查吞铁细胞的血样需抗凝，采血前应先在采血针管或收集血液的试管、小瓶内加入适当的抗凝剂（如5％的灭菌枸橼酸钠或0.1％的肝素等）。进行病毒学检查的血样，则用肝素（每16ml血液加入0.1％肝素1ml）或乙二胺四乙酸四钠（EDTA钠）（每10ml血液加入20mgEDTA钠）抗凝，而不用枸橼酸钠，因其对病毒有微弱的灭活作用，且在接种动物时易引起非特异性反应。

用于血清学试验的血样不能加抗凝剂，采出的血液（血量因容器大小和血清用量而定）轻轻（速度太快时可形成大量气泡，影响血清析出）注入灭菌试管等容器内放成斜面，在室温中充分凝固后直接将此试管用冰瓶冷藏递送。也可将血清吸入灭菌瓶内，密封后冷藏转送。如果送检时间较长，可加入0.01％硫柳汞、0.08％叠氮钠或0.5％石碳酸防腐。

如果检查血液内蠕虫（如丝虫病）、原虫（如伊氏锥虫、焦虫等）以及进行血液镜检，可采新鲜血液压片或推片后送检。

采集的血样加胶塞封口后贴上标签，置于冰瓶内迅速送至实验室。不能及时送达者，可暂时置入普通冰箱内于4℃下保存（如要进行血小板检查，则血样不宜低温保存），但要注意不可冻结或久置，以防发生溶血。血清每冻融一次，抗体效价都会有所下降。

如果动物曾接受过某种治疗，应在病料送检单和瓶签上说明用过何种药物。

2.腔道分泌物以及乳汁、脓液、水肿液和体腔积液的采集用灭菌棉花棒从管腔内（如口腔、鼻腔、食道、阴道等）蘸取分泌物后置于装有磷酸盐缓冲液或普通肉汤的容器内，并予以密封，以防棉花棒干燥而影响病原的活性和分离培养。采集乳汁时要先清洗和消毒乳房、乳头及术者手，弃去最初挤出的乳汁；采集脓液时，未破溃脓肿可在脓肿局部剪毛并以碘酊消毒、脱碘后，用灭菌注射器抽取。脓汁太浓时可先用注射器注入灭菌生理盐水2ml略做稀释后再抽取；已破溃的脓灶先消毒周围组织，然后除去表层脓液，以棉花棒蘸取深部脓汁；皮下水肿、体腔积液、关节囊积液或神经症状的动物，可在局部剪毛消毒后用无菌穿刺术采取有关病料。

采集体腔积液的穿刺部位：对胸腔积液，牛于右侧第五肋间或左侧第六肋间；马在右侧第六肋间或左侧第七肋间；对腹腔积水，马于剑状软骨后约10～15cm处的白线两侧或在最后肋骨的后缘左腹侧作垂线，再由膝盖骨向前引一水平线，两线交点至膝盖骨的中点即为穿刺部位；牛的部位与马相同，但位于右侧腹壁。关节液可用注射器在肿胀关节穿刺采取。

采得的穿刺液应迅速冷藏保存，并尽快送检。

3.水疱皮、痘痂皮及水疱液的采集和保存　水疱（痘疱）皮可用灭菌剪刀采取，应尽量多取一些，置入装有保护液的容器内，冷藏转送；水疱液、脓疱液与组织渗出液等或以灭菌注射器抽取，或以灭菌毛细吸管吸取（采取后迅速用火焰封口）。采集的棉拭子或抽取的疱液等病料应立即投入含有保护液的灭菌容器中密封冷藏。保护剂可用含10％犊牛血清的Hanks液，并在临用前加入青、链霉素各1000IU／ml，亦可用pH7.4左右的磷酸缓冲肉汤。

4.尿液的采集和保存　最理想的采集方法是用膀胱穿刺术，但在操作上有一定的技术要求。一般情况下可在病畜自然排尿时，用灭菌容器收集中段尿；对大家畜也可用导尿管采集尿液，在操作前要先用肥皂水和消毒药液清洗消毒外生殖器。采得的尿液必须立即置于4℃下保存送检，如在室温下超过1hs，即不适宜于供细菌检查之用。

5.粪便的采集和保存　小动物可用灭菌直肠棉拭子伸入直肠深处蘸取粪便法采取；大家畜可直接从直肠采取，将带有经过灭菌处理的乳胶或塑料长筒手套的手臂伸入直肠深部掏取少量粪便，取出后立即将手套长筒从手臂上翻转脱下，使粪样包在手套内，然后用线结扎密封，再剪去手套多余部分即可。亦可用压舌板插入直肠内并轻轻下压刺激直肠，促进排粪，用塑料袋或有盖容器收集。最好采集未经过药物治疗的动物的粪便，采集前先对肛门四周进行清洗消毒，采好的病料必须尽快冷藏送检。

（二）尸检病料的采取和保存

如果采集病料和病理学剖检同时进行，则一定要先采取病料，后做病理解剖学检查。

病畜禽死亡后应尽快剖检，间隔时间越短越好。要根据动物生前发病情况或对疫病的初步诊断，选择可能含有病原最多的各种病料予以采集。操作时必须按病理解剖和病料采集时必须注意的事项进行，使剖检和采样互不影响。

1.病料采取

（1）实质器官的采取。心、肝、脾、肾等实质器官，可选取病变典型部位及相邻部位正常组织，切取两块不小于4×2×2cm左右的小块；如要采集心内血液，应先对右心房部位用点燃的酒精棉进行火焰灭菌，然后用灭菌注射器抽取。

（2）淋巴结的采取。应注意将淋巴结和周围附带的脂肪组织一起采下，并尽可能多取几个。

（3）胃和肠管的采取。采取时要先用线双结扎靠近胃贲门的食道、近幽门处的十二指肠和欲取的肠管两端，自两道结扎线之间剪下。

（4）胆汁的采取。可用消毒注射器吸取胆汁数毫升，注入灭菌瓶内；对于胆囊较小的动物，可将整个胆囊采下。

（5）生殖系统的采取。应分别采取子宫、胎盘等病变部位的组织及其分泌物。死胎和木乃伊胎儿等可用浸有消毒液的纱布包裹后整体送检，或采取胎儿胃和内容物及其有病变的组织。对公畜必要时可取睾丸和附睾。

（6）脑组织的采取。脑组织取出后纵切为两半，一半置于50％的灭菌甘油生理盐水内，一半置于10％的甲醛溶液内，必要时应采集部分脊髓和脊髓液。

（7）其他情况下病料的采取。如果呼吸系统有问题，应采病变部位的组织及其邻近淋巴结；疑有肠毒血症时，可取出肠内容物送检；如尸体已腐败，可采取长骨或肋骨，从骨髓中分离病原。

2.病料保存采取到的病料应分别放入灭菌容器内密封，能立即送检的，置于冰瓶内送检；不能立即送检的，要采取相应的防腐措施，将病料置于保护液（见前）中。也可选用以下几种pH7.4的保护液：10％灭活兔血清、10％生理盐水卵黄液、2％生理盐水灭活马血清、无菌脱脂乳以及50％磷酸缓冲甘油液（此液对许多病毒有不同程度的灭活作用）和1％二甲基亚砜溶液（此液可防止核酸酶的破坏作用），应根据病料检验目的不同灵活选用。

也可将病料制成悬液乳剂，再冷冻送检。方法是将材料用缓冲生理盐水冲洗2～3次后磨碎，再用无菌营养肉汤或上述含10％犊牛血清的Hanks液作成1∶5～10的悬液乳剂，经1000～1500 r/min离心20min，吸取上清液，加入青、链霉素各1000IU／ml，分装于灭菌容器内，密封冻结或以湿冰冷藏送检。

对于进行血清学检查的样品，应注意作为抗原的样品必须保证抗原性不受破坏。如需做标记抗体检查，可将细菌或病毒性病料（组织、血液、脓汁、粪便、尿沉渣、穿刺液等）在薄型洁净无油的载玻片上制成薄而匀的涂片或压印片，自然干燥后用丙酮在4℃固定20～30min，晾干，密封包装后置4℃下迅速送检。

病料送检单上必须注明采取的保存方法。

（三）寄生虫检查所需病料的采集和保存

1.采集　蠕虫病料一般多采集粪便，血液原虫病一般采取血液，粪便和血液采取的方法同前。螨病病料在对皮肤剪毛后，用消过毒的凸刃小刀在皮肤上垂直刮取（对活体动物，力度应掌握至所刮皮肤发红或轻微出血为宜，之后要注意消毒），将刮取物置于培养皿内送检；寄生虫体可从腔道、皮肤等处剖出，或将脏器撕碎，于37℃温水中挤压、揉搓，反复沉淀。对于病变组织和寄生虫所在组织，选择病变典型部位连同周围健康组织切取大小适当的组织块送检。

2.保存

（1）粪便。可放到加热至50～60℃的福尔马林溶液中，冷却后密封保存。

（2）涂片。用甲醇固定后，片片相叠，涂片之间用火柴杆垫起，最外面的血膜向里，用细线捆扎后置于结实的盒子或箱包里送检。

（3）虫体。依种类而定。

吸虫：用生理盐水漂洗干净后，放在自来水中杀死，而后置于70％酒精中固定。

绦虫：虫体节片可按上述方法固定，也可用绦虫固定液固定，12hs后再移到70％酒精中保存；绦虫蚴及其病理标本可用10％福尔马林溶液固定。

线虫和棘头虫：大型虫体漂洗干净后，于4％的温热福尔马林溶液中保存；小型线虫用巴氏液或甘油酒精保存。固定时固定液应先加热至50℃左右，以使虫体彻底舒展。

病变组织和寄生虫所在组织：于10％福尔马林液中密封保存。

（四）病理组织学检查的病料的采集和固定

1.采集　进行病理组织学检查所需要的病料一般是动物的组织器官，采集时可按前文所述的分离细菌、病毒所需病料的采集方法进行，但采集下来后，必须立即投入固定液中予以固定。

2.病料固定的目的　对采集的组织器官病料进行固定，就是将从动物体内取下的新鲜组织器官立即投入固定剂中，借助固定剂的作用，使细胞组织的形态结构固定起来，防止其改变形态或发生变质。动物死亡后，血液循环即行停止，机体细胞也开始逐渐死亡，如不立即进行处理，组织器官内的细胞在水解酶的作用下，蛋白质分解，细胞溶解，引起组织变形并发生自溶现象。微生物繁殖又使组织器官开始腐败过程，组织结构遭到破坏，发生形态学的改变，就会失去组织学检查的意义。固定的目的一是可以防止组织溶解和腐败；二是使细胞内的蛋白质、脂肪、糖、酶等各种成分沉淀并被保存下来，保持其结构与生前状况相似；三是固定液使细胞中的蛋白质等物质凝固、沉淀，产生不同的折射率，造成光学上的差异，使组织器官的微观结构变得清晰起来，同时使细胞各部分容易染色，便于在显微镜下观察。四是固定剂使组织器官变硬，使组织硬化，从而不易变形，有利于固定后其他各个环节工作的进行。

3.常用的病理组织固定剂　常用的固定液有单纯固定液和混合固定液两种，每种都有很多种类，应根据病料及检验目的的不同选择使用。一般在采集病料之前应多准备几种，以备急需时使用。

（1）单纯固定液。是指单一的某种化学试剂，最常用的为甲醛（福尔马林，一般用10％的水溶液）、乙醇（酒精，一般用95％的溶液或无水酒精）、醋酸（乙酸，常用5％的溶液）等。前两种一般用于检验糖原、尿酸和色素的组织固定。

（2）混合固定液。是指两种或两种以上的不同化学试剂按不同的浓度、比例混合在一起而成的固定液。常用的有酒精福尔马林溶液，其配方是100ml福尔马林溶液中加入95％的酒精900ml即成。此液用于快速制片诊断，小块组织只需固定1～2小时，即可直接进入切片的下一步程序。

Bouin氏液　用于组织学和免疫组织化学固定。其配方为苦味酸饱和水溶液75ml加福尔马林25ml、冰醋酸5ml混合即成，用时临时配制。

Carnoy氏固定液　用于染色体、DNA、RNA、糖原的固定。其配方为纯酒精6份、冰醋酸1份、三氯甲烷3份混合均匀而成。

此外还有Zenker氏液、Maximov氏液、Heidenhain氏液等，可根据检查目的的不同灵活选用。

固定液的用量要相当于组织块总体积的5～10倍。病料固定时间不宜过长（过长可使组织发脆，切片时易碎），也不可过短（过短则固定不彻底）。例如用甲醛液固定，只需24～48hs即可，如在24hs时更换一次固定液更好。

三、病料的包装与送检要求

（一）遵守法律规定

《中华人民共和国动物防疫法》第二十二条规定：采集、保存、运输动物病料或者病原微生物以及从事病原微生物研究、教学、检测、诊断等活动，应当遵守国家有关病原微生物实验室管理的规定。送检病料时必须遵守本规定。

（二）送检要及时

为了尽快得出诊断结论和提高诊断的准确性，病料送检必须及时、迅速。病料封装好后，应尽快送到检验单位。短途可派人专门送检，路程远的可以托运。

（三）保证病料质量

病料保存和送检过程中要防止病料发生不利于诊断的变化，确保病料质量。用于细菌、病毒分离培养的病料，要保证病料中的病原不被抑制、杀死或灭活。

一般微生物学检验材料都怕受热，可将密封好的盛放病料的容器一个个用棉花纱布裹紧后直立于放有冰块的广口保温瓶中。路途较远的，高温季节送检时途中要更换或添加冰块。如无冰块，可在保温瓶内放置450～500g的氯化铵，加水1500ml，可保持0℃左右24hs。对于病毒性病料，如在24hs内不能送达，有条件的最好以冰冻状态送检，如将病料置于装有用干冰或液氮的冷藏瓶内送检，但要注意瓶口不能塞得太紧，以使瓶内气体能自由逸出，防止冷藏瓶爆裂；或先将病料组织在-30℃冻结后，再置于有大量冰块的冷藏瓶中送检，途中必须及时更换冰块，防止冻结的病料融化。但对于怕冻材料（如血液、血清、乳汁、脓液以及病理组织学材料、标本等）要保证不可冻结，夏季应于4℃左右的低温保存送检，冬季应用棉花将装有病料的容器一一包紧后装箱，外面注明“防冻”字样。

（四）确保安全

送检病料的容器要坚固，保证在可能的冲击、碰撞、颠簸、震荡情况下而不受损，防止运送途中发生意外。特别是对于危险材料及重大动物疫病材料（如疑为炭疽、口蹄疫、牛瘟等疫病的病理材料），应将封装好的病料装入一金属容器内，焊封加印后再装箱。装病料的塑料袋或容器应将容器封口向上，置于与箱子（或其他容器）四周保持一定距离的位置，底部先垫一层填充物，装病料的容器放入后再在四周及上部也塞满填充物，最后将箱子密封结实。箱外要用箭头标明上下，注明“切勿倒置”等字样，对于用玻璃容器盛装的病料更应如此。

对涂片材料，应将玻片相叠并扎紧送检，每张涂片之间用火柴杆垫起，最外面一片的涂层向里，用细线捆扎牢固后再装箱。

重大动物疫病或新发疫病的病料要由专人专送。如果路程太远，在温暖及炎热季节，也应派专人送检，以便在途中定时更换冰块，使送检材料始终处于适宜的温度环境。

（五）规范填写病料送检单

病料送检单上要注明病料种类、组织器官、部位、数量、编号、采取的日期、地点及送检单位等，并将剖检记录也一并附上。在寄送病理检验材料时，要附有详细的病例流行特点、病史、治疗情况及尸体剖检等记录。送检单应一式两份，一份存查，一份随病料送往检验单位。