胚胎移植的基本程序

1.5　胚胎移植的基本程序

胚胎移植的主要内容：供体和受体母牛的选择，供体母牛的超数排卵和受精，供体与受体母牛的同期发育，胚胎的回收，胚胎质量的鉴别，胚胎的冷冻保存，胚胎移植，受体的妊娠诊断等。

1.5.1　供体的选择

供体的选择是胚胎移植技术的一个重要环节。胚胎移植计划对供体资源要进行调查，依据调查资料，运用各种科学方法做出综合评定，选出符合要求的个体。要求供体既要有数量又要有质量，应有重要育种价值，经过血统、生产性能和体型审查，选择经济性能优越、生殖机能正常、对超数排卵有良好反应的健康母体。选择的首要条件是其遗传价值和生产性能、健康情况和繁殖品质，看其是否具备品种的体型外貌特征，按照能反应经济性状的遗传能力的数据进行挑选工作。要求供体除经济价值外，还要有健康的体质和良好的繁殖状态，在生产性能、繁殖和使用年限上具有较高的遗传力，具有重要的育种价值。所以，确定供体前需作必要的检查，进行严格的选择。

供体选择的原则　当制定应用胚胎移植计划时，一定要慎重选择适合的供体。供体要健康无疾病，具有较高的育种价值，生殖能力处于较高的水平。从技术和经济两方面考虑，供体选择可参考以下原则。

①品种优良　符合本品种标准，血统、体型外貌和生产性能全优，具有早熟性和长寿性，遗传性稳定、谱系清楚，无遗传缺陷。②体质健康　体质健壮、肢蹄强健、繁殖机能正常，无遗传病、传染病、难产、流产和繁殖障碍的经历或很低的助产率。发情周期不明显的繁殖障碍、患子宫内膜炎或长期空怀的，都不能作为供体。③年龄适宜　15月龄至8周岁以内为宜。④繁殖品质　具有较高的繁殖力，生殖器官正常，发情周期正常。从幼龄起发情周期就正常（或至少以前有过两次正常发情）的母牛，经产后60天以上，有两次正常发情记录；受胎性好，受胎率及配种指数较好，连续一年产一犊。⑤排卵成绩　母畜生殖器发育良好，尤其是卵巢、子宫的状态对超数排卵要有良好的反应，且排卵数多，采得的受精卵质量良好。⑥性情温顺　选择性情温顺的母畜作为供体，以便于操作。预作为供体的母畜，最好有一次完整的生产记录（产犊、产奶），以衡量其种用价值后，才有可能作为供体选择的对象。

以上标准只是一般性原则，根据实际情况可灵活运用，不可强求一律。

1.5.2　超数排卵

在母畜发情周期的适当时间，注射促性腺激素，使卵巢中有较多的卵胞发育和排卵，这种方法称为超数排卵。在进行胚胎移植时对供体作超数排卵处理，以便一次取得多枚胚胎。一般认为超排量最好是10个左右，太少会降低胚胎移植的意义，同时胚胎的收集也有困难，超排过多会降低卵子的受精率和收集率。

超排处理一般方法为在预计发情到来之前4天，即发情周期的第16天注射促卵泡素或孕马血清促性腺激素，在出现发情的当天注射绒毛膜激素。

目前各国对供体作超数排卵处理的方法是在供体发情周期的中期肌注孕马血清促性腺激素，以诱导多个卵泡发育，两天后肌肉注射PGF2a或其类似物消除黄体，约2～3天后发情。

表1-3　各国超排处理方法

为了使排出的卵子有较多的受精机会，一般在发情后输精2～3次，每次间隔8～12小时。母牛对超排处理的个体反应差异较大，原因可能与母牛的品种、年龄、体况、生理状态、制剂质量、投药方法和剂量等因素有关。

1.5.3　胚胎回收（采卵）

从供体收集胚胎的方法有手术法和非手术法两种。

手术法　按外科剖腹术的要求进行术前准备。手术部位，牛在右肋部或腹下乳房至脐部之间的腹白线处；羊位于腹中线或肷部。手术切开后，伸进食指找到输卵管和子宫角，引出切口外。如果输精后3～4天内采卵，受精卵还未移行到子宫角，可采用输卵管冲卵的方法。将一直径2毫米，长约10厘米的聚乙烯管从输卵管腔口插入2～3厘米，另用注射器吸取5～10毫升30℃左右冲卵液，连接7号针头，在子宫角前端刺人，再送入输卵管峡部，注入冲卵液，穿刺针头应磨钝，以免损伤子宫内膜；冲洗速度应缓慢，使冲洗液连续地流出，如果在输精后5天收胚，还必须作子宫角冲胚，即用10～15毫升冲卵液由宫管结合部子宫角上部向子宫角分叉部冲洗。为了使冲卵液不致由输卵管流出，可用止血钳夹住宫管结合部附近的输卵管，在子宫角分叉部插入回收针，并用肠钳夹住子宫与回收针后部，固定回收针，使冲卵液不致流入子宫内。

非手术法　牛多采用非手术采卵，一般在输精后5～7天进行。采用二路导管的冲卵器。二路式冲卵器是由带气囊的导管与单路组成。导管中一路为气囊充气用，另一路为注入和回收冲卵液用。

导管中插1根金属通杆以增加硬度，使之易于通过子宫颈。一般用直肠把握法将导管经子宫颈导人子宫角。为防止子宫颈紧缩及母牛努责不安，采卵时可在腰荐或尾椎间隙用2％的普鲁卡因或利多卡因5～10毫升进行硬膜外腔麻醉。操作前洗净外阴部并用酒精消毒。为防止导管在阴道内被污染，可用外套膜（有商品出售）套在导管外，当导管进入子宫颈后，扯去套膜。将导管插入一侧子宫角后，向气囊充气，使气囊胀起并触及子宫角内壁，以防止冲卵液倒流。然后抽出通杆，经单路管向子宫角注入冲卵液，每次15～50毫升。冲洗5～6次，并将冲卵液收集在漏斗形容器中。为更多地回收冲卵液，可在直肠内轻轻按摩子宫角。用同样方法冲洗对侧子宫角。

冲洗液多数为组织培养液，如林格氏液、杜氏磷酸缓冲液、布林斯特氏液（BMOC-3）和TCM-199等。常用的为杜氏磷酸缓冲液（PBS），加入0.4％的牛血清蛋白或1％～10％小牛血清。布林斯特氏液效果也较好。这两个培养液的成分见表1-4。

表1-4　组织培养液成分（克/100毫升双蒸馏水）

冲洗液使用时温度应为35～70℃,每毫升要加入青霉素1000单位，链霉素500～1000微克，以防止生殖道感染。

1.5.4　胚胎检查

检卵　将收集的冲卵液于37℃温箱内静置10～15分钟。胚胎沉底后，移去上层液。取底部少量液体移至平皿内，静置后，在体视显微镜下先在低倍（10～20倍）下检查胚胎数量，然后在较大倍数（50～100倍）下观察胚胎质量。把正常发育的胚胎收集于带有密闭盖的玻璃容器内备用贮存。

吸卵　吸卵是为了移取、清洗、处理胚胎，要求目标准确、速度快、带液量少、无丢失，吸卵可用1毫升的注射器装上特别的吸头进行，也可使用自制的吸卵管。

胚胎质量鉴定　正常发育的胚胎，其中细胞（卵裂球）外形整齐，大小一致，分布均匀，外膜完整。无卵裂现象（未受精）和异常卵（外膜破裂、卵裂球破裂等）都不能用于移植。

正常胚胎

1.5.5　胚胎的保存

如果胚胎能在体外较长期的保存，并保持取卵时的状态，对胚胎移植的实际应用很有意义。这样就可以免去移植时要求的同期发情，处理可以不受时间、地点和选定受体母牛的限制，随时随地进行胚胎移植。胚胎保存的研究近年来发展很快，并已取得了一定的进展。

在前述培养液中，如在室温或体温条件下，胚胎只能存活10～20小时。当温度降至20℃以下时，胚胎停止发育，存活时间可以延长；胚胎在10℃以下可以存活数日。牛的胚胎在兔的输卵管内可保存3～4天。据报道，曾在母兔输卵管内保存3～4天的牛胚胎移植到同期化受体青年母牛，胚胎成活率可达73％。上述方法时间短，受胎率不高。目前冷冻保存胚胎的研究已取得了成果。

用于冷冻保存的胚胎以6～7日龄胚胎，即桑椹期至胚泡开始出现时的胚胎效果较好。

胚胎冷冻前必须使其脱水，进行冷冻保护剂二甲基亚矾（DMSO）的渗透处理。在室温下（20℃），预先配制0.25摩尔、0.50摩尔、1.00摩尔、1.50摩尔的DMSO+0.4％牛血清白蛋白的PBS溶液（磷酸缓冲液）。将胚胎依次浸入上述不同DMSO浓度的溶液中进行渗透处理，在每个浓度溶液中分别停留5～10分钟。最后用吸管将含胚胎的0.3毫升的细管里长颈安瓿中，并将口封好。以上操作均在解剖镜下进行，然后将安瓿置于14℃的水浴中。

胚胎冷冻以液氮为冷源，在可控制温度的液氮冷冻箱内进行。冷冻速率：14℃～-7℃每分钟下降1℃，-7℃时用在液氮中浸过的金属镊子夹一下有胚胎的安瓿，使之诱导结晶，胚胎迅速被玻璃化冻结，而不致产生有害的冰结晶。-7℃～36℃每分钟下降0.3℃，-36℃～-60℃每分钟下降0.1℃，-60℃时直接投入液氮中保存。

胚胎的解冻比冷冻速度快，-196℃～-50℃（干冰酒精溶液中），-50℃～14℃每分钟升温4℃。解冻后，通常在室温下将安瓿打开，脱去冷冻保护剂DMSO。方法是将胚胎依次移入含1.25摩尔、1.00摩尔、0.75摩尔、0.50摩尔DMSO的磷酸缓冲液中，在每种浓度的溶液中各停留5～10分钟，0.50摩尔溶液中可停留30分钟，最后移入不含DMSO的磷酸缓冲溶液中停留10分钟。再用磷酸缓冲液冲洗2次，取出后检查即可用于移植，也可以培养1小时（在37℃培养液中），将其中死的胚胎去掉再移植，效果更好。

从以上情况看，冷冻保存胚胎虽然冻后成活率和受胎率还很低，还需要在培养液、防冻保护剂、降温和升温速率等问题上进行深入的研究，但这确是胚胎保存技术的重大突破。

1.5.6　胚胎移植

胚胎移植也分为手术法和非手术法。诱产双胎为目的的移植一般采用非手术法。手术法如前所述先将受体母牛作好术前准备，在右胁部切口，找到非排卵侧子宫角（已配种母牛），再把吸有胚胎的注射器或移卵管刺入子宫角前端，注入胚胎；或在每侧子宫角各注入一个胚胎（未配母牛）。注入完毕后即将子宫复位，进行伤口缝合。

非手术法移植是用人工授精输精器（卡苏枪）或专用移卵器按照直肠把握输精方法插入非排卵侧子宫角深部，注入胚胎。非手术法的移植在发情周期的6～9天进行（即胚泡阶段），效果较好。非手术法不损害受体的健康，操作简便，但是需要克服所注入胚胎易被排出的问题。非手术法移植要严格遵守无菌操作规程，以防止生殖道感染。

不论用何种方法移植胚胎，供体和受体的发情期应相同或前后相差不超过24小时，否则，将会影响成功率。所以在胚胎体外保存方法没有得到较好的解决之前，必须对供体和受体进行同期发情处理，使两者性腺和生殖道处于相同的生理状态，以提高移植成活率。供体和受体笔术后要注意观察是否发情。供体发情时即可正常配种，或经过40～80天再重复作为供体。受体母牛如未发情，在适当时间进行妊娠检查。若确已妊娠，应加强饲养管理。诱产双胎的受体母牛、以成年母牛较好，可以减少分娩困难。