细菌内毒素检查

第二节　细菌内毒素检查

一、概念

利用鲎试剂来检测或量化由革兰氏阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。

二、技术依据及原理

本法系用鲎试剂与细菌内毒素产生凝集反应及内毒素在二价阳离子的参与下，作用于鲎血凝集酶系统而发生的一系列酶联反应，最后形成凝胶，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。内毒素单位用EU表示。

细菌内毒素国家标准品系自大肠杆菌提取精制而成，用于标定、复核、仲裁鲎试剂灵敏度和标定细菌内毒素工作标准品的效价。

细菌内毒素工作标准品系以细菌内毒素国家标准品为基准标定其效价，用于试验鲎试剂灵敏度复核、干扰试验及设置的各种阳性对照。细菌内毒素工作标准品中每1mg细菌内毒素的效价应不小于2EU，不大于50EU。

细菌内毒素检查用水系指与灵敏度为0.03EU/ml或更高灵敏度的鲎试剂，在37℃±1℃条件下24h不产生凝集反应的灭菌注射用水。

三、试验准备

试验所用器皿需经处理，除去可能存在的外源性内毒素，常用的方法是250℃干烤至少1h，也可用其他适宜的方法，并应确证不干扰细菌内毒素的检查。试验操作过程应防止微生物的污染。

四、鲎试剂灵敏度复核试验

鲎试剂灵敏度定义为在本检查法规定的条件下能检测出内毒素标准溶液或供试品溶液中的最低内毒素浓度，用EU/ml表示。

根据鲎试剂灵敏度的标示值（λ），将细菌内毒素国家标准品或细菌内毒素工作标准品用细菌内毒素检查用水溶解，在旋涡混合器上混匀15min，然后制成2.0λ、1.0λ、0.5λ、0.25λ等4个浓度的内毒素标准溶液，每稀释一步均应在旋涡混合器上混合30秒钟，按检查法项下试验，每一浓度平行做4支，同时用细菌内毒素检查用水做2支阴性对照管，如最大浓度2.0λ管均为阳性，最低浓度0.25λ管均为阴性，阴性对照管均为阴性，按下式计算反应终点浓度的几何平均值，即为鲎试剂灵敏度的测定值（λ）。

λC＝lg^－1（∑X/4）

公式中的X为反应终点浓度的对数值（lg）。反应终点浓度是系列浓度递减的内毒素溶液中最后一个呈阳性结果的浓度。

当λ在0.5λ～2.0λ（包括0.5λ和2.0λ）时，方可用于细菌内毒素检查，并以λ为该批鲎试剂的灵敏度。每批新的鲎试剂在用于试验前都要进行灵敏度的复核。

五、供试品干扰试验

按鲎试剂灵敏度复核试验项下，用细菌内毒素检查用水和未检出内毒素的供试品溶液或其不超过最大有效稀释倍数（MVD）的稀释液，分别将同一支（瓶）细菌内毒素工作标准品制成含细菌内毒素工作标准品2.0λ、1.0λ、0.5λ、0.25λ等4种浓度的内毒素溶液。用细菌内毒素检查用水和用供试品溶液或其稀释液制成的每一浓度平行做4支，另取细菌内毒素检查用水和供试品溶液或其稀释液各做2支阴性对照管。如最大浓度2.0λ管均为阳性，最低浓度0.25λ管均为阴性，阴性对照管均为阴性时，按下式计算用细菌内毒素检查用水制成的内毒素标准溶液的反应终点浓度的几何平均值（ES）和用供试品溶液或其稀释液制成的内毒素溶液的反应终点浓度的几何平均值（Et）。

Es＝lg^－1（∑X_S/4）

Et＝lg^－1（∑X_t/4）

式中E_S、E_t分别为细菌内毒素检查用水和供试品溶液或其稀释液制成的内毒素溶液的反应终点浓度的对数值（lg）。

当Es0.5λ～2.0λ（包括0.5λ和2.0λ）时，且当Et在0.5Es和2.0Es（包括0.5Es和2.0Es）时，则认为供试品在该浓度下不干扰试验，否则使用更灵敏的鲎试剂，对供试品进行更大倍数稀释或采用其他适合排除干扰作用的方法。当鲎试剂、供试品的来源、供试品的配方或生产工艺有变化时，须重新进行干扰试验。

供试品的最大有效稀释倍数（MVD）按下式计算：

MVD＝CL/λ

式中L为供试品的细菌内毒素限值；C为供试品溶液的浓度。其中当L以EU/ml表示时，C为1.0ml/ml；当L以EU/mg或EU/u表示时，C的单位为mg/ml或u/ml。

六、检查法

取装有0.1ml鲎试剂溶液的10ml×75mm试管或复溶后的每支0.1ml规格的鲎试剂原安瓿5支，其中2支加入0.1ml按最大有效稀释倍数稀释的供试品溶液作为供试品管，1支加入0.1ml用细菌内毒素检查用水将细菌内毒素工作标准品制成2.0λ浓度的内毒素溶液作为阳性对照管，1支加入0.1ml细菌内毒素检查用水作为阴性对照管，1支加入0.1ml供试品阳性对照溶液〔用被测供试品溶液将同一支（瓶）细菌内毒素工作标准品制成2.0λ浓度的内毒素溶液〕作为供试品阳性对照管。将试管中溶液轻轻混匀后，封闭管口，垂直放入37℃±1℃适宜恒温器中，保温60min±2min。保温和拿取试管过程应避免受到振动造成假阴性结果。

七、结果判断

将试管从恒温器中轻轻取出，缓缓倒转180°时，管内凝胶不变形，不从管壁滑脱者为阳性，记录为（＋）；凝胶不能保持完整并从管壁滑脱者为阴性，记录为（－）。供试品2支均为（－），应认为符合规定；如2支均为（＋），应认为不符合规定；如2支中1支为（＋），1支为（－），按上述方法另取4支供试品管复试，4支中1支为（＋），即认为不符合规定。阳性对照管为（－）或供试品阳性对照管为（－）或阴性为（＋），试验无效。