紫外可见分光光度法

第二节　紫外可见分光光度法

一、概念

通过测定被测物质在紫外-可见分光波长处或一定波长范围内的吸光度或发光强度，对该物质进行定量或定性分析的方法。本法在药品检验中主要用于鉴别、检查和含量测定。

二、技术依据及原理

当溶液浓度不变时，吸收度与溶液的液层厚度成正比；当溶液液层厚度不变时，吸收度与溶液的浓度成正比。朗玻—比尔定律为：吸收度（A）与溶液的浓度（C）和光路长（L）是成正比的。可用公式表示A＝ECL（式中E为吸收系数）。

定量分析通常选择物质的最大吸收波长处测出吸收度，然后用对照品或百分吸收系数算出被测物质的含量，多用于制剂的含量测定；对已知物质定性可用吸收峰波长或吸收度比值作为鉴别方法；若化合物本身在紫外光区无吸收，而杂质在紫外光区有相当强度的吸收，或杂质的吸收峰处化合物无吸收，则可用本法作杂质检查。

三、仪器的校正和检查

1.波长

由于环境因素对机械部分的影响，仪器的波长经常会略有变动，因此除应定期对所用的仪器进行全面校正检定外，还应于测定前校正测定波长。常用仪器中氘灯的486.02nm与656.10nm谱线进行校正，钬玻璃在279.4nm、287.5nm、333.7nm、360.9nm、418.5nm、640.0nm、484.5nm、536.2nm与637.5nm波长处有尖锐吸收峰，也可作波长校正用，但因来源不同或随着时间的推移会有微小的变化，使用时应注意。

2.吸光度准确度

可用重铬酸钾的硫酸溶液检定。取在120℃干燥至恒重的基准重铬酸钾约60mg，精密称定，用0.005mol/L硫酸溶液溶解并稀释至1000ml，在规定的波长处测定并计算吸收系数，应符合下表的规定。

表6-1　吸光度检定液吸光系数对照表

3.杂散光的检查

可按下表所列的试剂和浓度，配制成水溶液，置1cm石英吸收池中，在规定的波长处测定透光率，应符合表中的规定。

表6-2　杂散光检查透光率对照表

4.对溶剂的要求

测定供试品前，应先检查所用的溶剂在供试品所用的波长附近是否符合要求，即将溶剂置于1cm石英吸收池中，以空气为空白（即空白光路中不置任何物质）测定其吸光度。溶剂和吸收池的吸光度，在220～240nm范围内不得超过0.40，在241～250nm范围内不得超过0.20，在251～300nm范围内不得超过0.10，在300nm以上时不得超过0.05。

5.用作鉴别和检查

分别按各种项下的方法进行。

四、测定法

除另有规定外，应以配制供试品溶液的同批溶剂为空白对照，采用1cm的石英吸收池，在规定的吸收峰波长±2nm以内测试几个点的吸收度，或由仪器在规定波长附近自动扫描测定，以核对供试品的吸收峰波长位置是否正确。除另有规定外，吸收峰波长应在该品种项下规定的波长±2nm以内，并以吸收度最大的波长作为测定波长。一般供试品溶液的吸收度读数，以在0.3～0.7的误差较小。仪器的狭缝波带宽度应小于供试品吸光度不再增加为准。由于吸收池和溶液本身可能有空白吸收，因此测定供试品的吸收度后应减去空白读数，或由仪器自动扣除空白读数后再计算含量。

1.对照品比较法

按各品种项下的方法，分别配制供试品溶液和对照品溶液；对照品溶液中所含被测成分的量应为供试品溶液中被测成分标示量的100％±10％，所用溶液也应完全一致，在规定的波长测定供试品溶液和对照品溶液的吸光度后，按下式计算供试品中被测溶液的浓度：

C_X＝（A_X/A_R）C_R

式中：C_X为供试品溶液的浓度（mg/ml）；

　　　A_X为供试品溶液的吸光度；

　　　C_R为对照品溶液的浓度（mg/ml）；A_R为对照品溶液的吸光度。

2.吸收系数法

按各品种项下的方法配制供试品溶液，在规定的波长处测定吸光度，再以该品种在规定条件下的吸收系数计算含量。用本法测定时，吸收系数通常应大于100，并注意仪器的校正和检定。