第三节 高效液相色谱法
一、概念
系采用高压输液泵将规定的流动相泵入装有填充剂的色谱柱进行分离测定的色谱方法。注入的供试品，由流动相带入柱内，各成分在柱内被分离，并依次进入检测器，由记录仪、积分仪或数据处理系统记录色谱信号。
二、技术依据及原理
液相色谱法是一种现代液体色谱法，其基本方法是将具有一定极性的单一溶剂或不同比例的混合溶液，作为流动相，用泵将流动相注入装有填充剂的色谱柱，注入的供试品被流动相带入柱内进行分离后，各成分先后进入检测器，用记录仪或数据处理装置记录色谱图或进行数据处理，得到测定结果。由于应用了各种特性的微粒填料和加压的液体流动相，本法具有分离性能高，分析速度快的特点。
高效液相色谱法适用于能在特定填充剂的色谱柱上进行分离的药品的分析测定，特别是多组分药品的测定、杂质检查和大分子物质的测定。有的药品需在色谱分离前或分离后经过衍生化反应方能进行分离或检测。
三、仪器的使用要求
按国家质量技术监督局的计量检定规程作定期检定，应符合规定。
仪器各部件应能正常工作，管路为无死体积联结，流路中无堵塞或漏液，在设定的检测器灵敏度条件下，色谱基线噪音或漂移应能满足分析要求。
具体仪器在使用前应详细参阅操作说明书。
四、操作前的准备
1.流动相的制备
用高纯度的试剂配制流动相，溶剂照紫外分光光度法进行检查，应符合要求；水为新鲜的去离子水；凡规定的酸度用pH计进行调节；配制好的流动相通过适宜的0.45μm滤膜滤过；用前脱气；配制足量的流动相待用。
2.供试溶液的配制
供试品用规定溶剂配制成供试溶液。定量测定时，对照品溶液和样品供试溶液均应分别配制2份。溶液在进入色谱仪前，经0.45μm滤膜滤过。必要时，在配制供试溶液前，样品需经提取净化，以免对色谱系统产生污染或对色谱干扰。
3.检查上次使用记录和仪器状态
检查色谱柱是否适用于本次试验，色谱柱进出口位置是否与流动相的流向一致，原保存溶剂与现用流动相能否互溶，流动相的pH值与该色谱柱是否相适应，检测器是否适用于本次试验，仪器是否完好，仪器的各开关位置是否处于关断的位置。
五、操作
按高效液相色谱仪操作规程测定，含量测定的对照品和样品供试溶液每份至少进样2次，由全部进样结果（n≥4）求得平均值，相对标准偏差（RSD）一般应不大于1.5％。
色谱系统适用性试验应符合要求，如按指定峰计算的理论板数（n）和拖尾因子（T）以及相邻峰之间的分离度（R）。计算公式为：
式中：tR2为相邻两峰中后一峰的保留时间；
tR1为相邻两峰中前一峰的保留时间；
W1及W2为此相邻两峰的峰宽；
W0.05h为0.05峰高处的峰宽；
d1为峰极大至前沿之间的距离。
定量测定时，可根据供试品的具体情况采用峰面积法或峰高法。测定杂质含量时，需采用峰面积法。
外标法：用含对照品的对照溶液所得色谱峰响应值，按下式计算：
式中：CX为供试品的浓度（mg/ml）；
AX为供试品的峰面积或峰高；
CR为对照品的浓度（mg/ml）；
AR为对照品的峰面积或峰高。
内标法：用含对照品和内标物质的对照溶液所得色谱峰响应值，按下式计算。
式中：As为内标物质的峰面积或峰高；
Cs为内标物质的浓度（mg/ml）；
CR为对照品的浓度（mg/ml）；
AR为对照品的峰面积或峰高。
式中：AX为供试品峰面积或峰高；
CX为供试品的浓度（mg/ml）；
A'S为内标物质峰面积或峰高；
C'S为内标物质的浓度（mg/ml）；f为校正因子。
面积归一化法：由于峰面积归一化法测定误差大，因此，本法通常只能用于粗略考查供试品中的杂质含量。除另有规定外，一般不宜用于微量杂质的检查。方法是测量各杂质峰的面积和色谱图上除溶剂峰以外的总色谱峰面积，计算各峰面积占总峰面积的百分率，即得。
清洗和关机：样品分析完毕，按高效液相色谱仪操作规程冲洗色谱系统，关机。
填写仪器使用记录，内容包括日期、检品、色谱柱、流动相、柱压、使用小时数、仪器完好状态等。
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