结核分枝杆菌感染实验模型

第九节　结核分枝杆菌感染实验模型

尽管结核分枝杆菌可感染并引起许多动物疾病，但人类是其中心宿主。为研究结核分枝杆菌的致病机理及宿主对本病原的保护性和免疫病理学反应，选择合适的动物模型非常必要。实验模型的合理选用将促进我们对结核病的认识，从中获取的研究信息将有助于我们探寻适宜的针对人类及动物结核病的预防和治疗方案。

结核分枝杆菌研究模型大大促进了我们对结核病发病机理、病理学和免疫学等方面的认识。由于结核病的复杂性，对使用动物准确模拟结核病提出了更高的要求。不过，由于大多数动物对结核分枝杆菌易感，其研究模型的选择范围较广。在模型的选择上，必须考虑研究内容、费用、动物来源、是否有生物安全三级以上的实验室等因素。初次使用的动物模型需要详述其各项指标，以及这些模型在研究结核病宿主和动物因素方面的潜在价值。

结核分枝杆菌的研究主要有两类模型：动物模型和组织培养模型。动物模型获得的结果更有价值，它可用以研究结核病的各个发病阶段。组织培养模型易于操作，可较快得到实验结果，但仅限于研究结核分枝杆菌感染的早期阶段。

一、动物模型

研究分枝杆菌致病过程中，动物选择非常重要。动物模型在结核病发病机理、病理学和免疫学研究中发挥了重要作用。主要有6种动物模型用于分枝杆菌研究，包括小鼠、豚鼠、兔、非人灵长类、鱼类和牛，每种动物模型各有其优缺点。

1.小鼠模型

小鼠由于其遗传背景清楚，测定细胞因子的试剂容易获得，与其他模型动物相比价格较低，且定向基因敲除技术比较成熟等，因此是体内研究结核分枝杆菌最常用的模型。小鼠被广泛应用于结核分枝杆菌突变、免疫反应、药效评价和疫苗筛选等方面的研究。不同品系的鼠对结核分枝杆菌的敏感性不同。小鼠可以通过多种途径感染，包括静脉、腹腔、气管感染，但最常用的方法是结核分枝杆菌气溶胶感染。

气溶胶感染的方法如下：在一个密闭空间内注入结核分枝杆菌气溶胶，将鼠全部或仅将鼻子暴露于气溶胶，感染剂量通过调节感染时间或细菌浓度实现。低剂量的气溶胶感染（约50CFU），可使小鼠肺部的细菌量缓慢稳定地增加，4周达到峰值，与肺部T细胞达到的峰值一致。初期被认为是感染的急性阶段，适用于研究结合分枝杆菌诱导的免疫反应。随后，细菌扩散到纵隔淋巴结内，可能进入树突状细胞。不同品系的小鼠对结核分枝杆菌的敏感性不同。现阶段，C57BL/6J小鼠是近交系小鼠中对结核杆菌最敏感的动物。 C57BL/6J小鼠感染后1～2周可检测到细菌的传播；大约2周后，感染可扩散到脾脏和淋巴结； 4周后细菌量达到稳定，肺部CFU约为106，数月内细菌量保持稳定。数据显示，慢性感染阶段，细菌的复制速度降低，处于休眠状态。最近的研究表明，结核分枝杆菌抗原在慢性感染小鼠肺内持续积累。慢性感染期内，免疫抑制可引起疾病的复发和结核病的暴发。

尽管小鼠模型在结核病研究中具有很多优势，但也有其缺点。首先，小鼠模型很难模拟人的潜伏期感染。人初次感染结核分枝杆菌时，疾病通常被控制，无明显症状。小鼠尽管疾病被控制，细菌量仍保持较高水平，细菌在肺内的持续存在加重了其病变，所有小鼠疾病呈慢性进行性过程。小鼠模型的另一个缺点是不能模拟人肺部病变，小鼠和人形成的肉芽肿完全不同，人肉芽肿具有特异性的结构，由淋巴细胞和巨噬细胞组成，巨噬细胞包围在淋巴细胞周围。小鼠肉芽肿也由淋巴细胞和巨噬细胞组成，但细胞排列不像人肉芽肿典型。人肉芽肿通常发展为干酪样坏死，纤维化、钙化甚至肺空洞，且含菌量不同。小鼠肉芽肿类型差异较小，不能发展为坏死，除非肺含菌量极高，而且观察不到干酪样坏死和肺空洞。

2.豚鼠模型

豚鼠被广泛应用于结核病的研究。低剂量的结核分枝杆菌气溶胶感染，在几个月到一年内，就可引起致死性结核病，病理变化呈进行性。豚鼠肉芽肿与人肉芽肿相似，结构较典型，可发展为坏死，且肉芽肿内细菌含量较低。因此，豚鼠是研究结核病传播和继发性肉芽肿形成的有用模型。豚鼠被认为是结核分枝杆菌最易感的动物模型，加上其结核病变与人的病变相似，故常作为药物和疫苗试验模型。Ordway等（2007年）使用流式细胞技术结合免疫组化跟踪检测T细胞、B细胞、异嗜性细胞和嗜酸性粒细胞。结果发现，参与反应的T细胞主要是CD4^＋T细胞。感染30天后，豚鼠肺内这些细胞的数量显著下降。相反，B细胞和粒细胞的数量逐步增加，这两类细胞的增加与肺部病变加剧密切相关，这项研究揭示出一个新的信息，即豚鼠感染结核分枝杆菌时，介导保护性免疫反应和宿主免疫病理学的细胞类型不同。豚鼠还被用于一些结核分枝杆菌突变株检验试验以鉴定其毒力因子。

与其他大动物相比，豚鼠价格相对较低，且易于在BSL-3实验室饲养。但用于免疫学分析如流式细胞仪、细胞因子测定和免疫组化的试剂还很少，其作为实验动物的使用受到一定的限制。

3.兔模型

实验中使用的兔通常对结核分枝杆菌不敏感。但最近的数据显示，结核分枝杆菌某些强毒株可引起兔进行性感染。兔对牛分枝杆菌极度敏感，其肺部病变与人肺结核很相似，故兔常用于牛分枝杆菌的研究。兔的肉芽肿结构与人的相似，也可发展为干酪样坏死和肺空洞。Converse等（1996年）首次描述并分析了肺空洞形成的全过程。使用不同剂量的牛分枝杆菌强毒株气溶胶感染新西兰白兔，低剂量和高剂量感染都可使兔发展为液化型坏死和肺空洞，肺空洞最早形成于感染后6周。原发性肺空洞有时可引起临近肺组织的继发性肺空洞。但最常见的情况是，肺空洞内的细菌扩散到支气管，经消化道在回盲交界处的淋巴组织引起继发性肺结节。

兔模型也用于研究结核病的潜伏期感染。Manabe等（2007年）用结核分枝杆菌H37Rv气溶胶感染兔模拟人类潜伏期结核病，结果发现，肺部含菌量感染后5周达到最大，随后疾病被控制。用皮质类固醇类药诱导兔免疫抑制后，引起了结核病的再复发，停药后，一部分兔发展为弥散性干酪样肉芽肿，从而构建了结核病潜伏期感染、再复发免疫重建炎症综合症（IRIS）的兔模型。最近，兔模型也用于不同毒株之间的毒力比较和结核性脑膜炎（TBM）的研究。结核性脑膜炎是一种严重威胁人类的结核病，主要发生于儿童和免疫力低下的成年人。Tsenova.L等（2007年）使用兔作为结核性脑膜炎的试验模型，比较了BCG免疫对结核分枝杆菌临床分离强毒株HN878和实验株H37Rv感染的兔中枢神经系统的保护效力。结果发现，BCG对两种毒株感染均有保护力，但对HN878强毒株的攻击保护力较差。并且，BCG不能够阻止细菌向肝、脾扩散，也不能阻止兔体重减轻，肺部和脑部病变及疾病症状的出现。因此研究者建议，新开发的疫苗在应用动物模型检验其效力时，除了结核分枝杆菌H37Rv标准株外，还应使用不同的临床分离株攻毒，包括强毒力的北京临床分离株。

兔用于结核分枝杆菌试验模型的缺点包括：首先，兔在BSL-3实验室环境中饲养难度较大，成本比小鼠和和豚鼠高。另外，与豚鼠相似，可用于免疫学分析的试剂有限。

4.非人灵长类模型

结核病的非人灵长类模型有很长的历史。最常用的灵长类动物结核病模型是短尾猴和恒河猴。然而由于费用较高，在BSL-3实验室里饲养困难；猴子的来源渠道少，实验样本有限；猴子容易爆发结核病，使其使用受到限制。

近年来，人们将猴子作为结核病模型的研究兴趣增加。尽管以前资料认为，恒河猴对结核分枝杆菌极度易感，但来自Flynn研究小组的数据表明，就像人结核，恒河猴感染结核分枝杆菌也会出现不同的后果。研究人员通过将低剂量的结核分枝杆菌直接注入恒河猴的肺部，引起所有恒河猴感染，然而，仅有40%发展为肺结核，60%无症状。他们用相同的方法对恒河猴潜伏期结核研究发现，感染能自动复发，或通过免疫抑制再激活。其结核病和再激活模型，与人类观察到的疾病相似。

与其他动物相比，非人灵长类动物模型有如下优点：第一，对结核杆菌通过自然途径感染很敏感，可发展为与人体相似的疾病，包括临床表现、组织病理学变化等。第二，恒河猴是能够较好地反映人类结核潜伏感染的动物模型。第三，用于免疫学和病理学分析的试剂容易获得，某些情况下，与人交叉反应试剂也可使用。最重要的一点是，其可作为结核病和艾滋病共感染模型，研究免疫缺陷病毒（HIV）和结核分枝杆菌在同一宿主内的相互作用。最后，疫苗和药物开发也常用此模型，从这些模型中获得的实验结果对于人的临床试验非常有用。

5.牛模型

牛是牛分枝杆菌的自然宿主，其对结核分枝杆菌也自然易感，因此从牛感染牛分枝杆菌的模型获得的资料对于评价结核分枝杆菌感染，研究疾病的发生、发展规律及疫苗的保护效力具有重要的参考价值。Rodgers（2007年）将104CFU的牛分枝杆菌以气溶胶形式感染4～5月龄牛，研究气溶胶吸入后牛分枝杆菌存在的部位，感染后细菌的分布及引起的病变。结果表明，气溶胶感染方法成功复制了牛分枝杆菌在体内传播的主要方式。

使用牛模型常用于检验牛疫苗候选株，将103～104CFU的牛分枝杆菌气溶胶攻毒，观察到典型的肉芽肿和优势细胞免疫反应。使用该模型，Hewinson等（2003年）开发了抗原鸡尾酒方法，当用全血γ-干扰素分析时，能够鉴别牛分枝杆菌野毒感染动物和疫苗免疫动物。他们还总结出了与病理学变化相关的免疫学指标，不需要病理剖检就可评价疫苗是否对牛分枝杆菌感染提供保护。使用这一模型开发出的疫苗和诊断试剂对于研究人类结核分枝杆菌的感染具有很好的参考价值。

6.鱼类

Talaat（1998年）和Bouley（2001年）科研小组分别用金鱼和斑马鱼模型研究了海牛分枝杆菌。海牛分枝杆菌是鱼类的自然病原，感染形成干酪性坏死性肉芽肿。鱼类模型和青蛙模型用于研究分枝杆菌的潜在毒力因子。 Cosma（2004年）用斑马鱼的胚胎作为模型，实验发现肉芽肿的形成过程可以被实时检测到。使用该模型显示，鱼类并发感染分枝杆菌时，后感染分枝杆菌直接进入已形成的肉芽肿。这个未曾预料到的有趣发现表明：肉芽肿可以控制感染，但细菌也可能利用肉芽肿环境为其存活提供保护。鱼类模型的这个独特特性，解决了利用人类或其他结核病模型很难甚至不可能解决的问题。这一发现为我们认识分枝杆菌发病机理和宿主反应提供了一种新的范例。

表1-1　5种结核分枝杆菌感染研究中常用的动物模型特性比较

注：“＋”的数量表示各种动物模型显示各项特征的相关程度，“-”表示无相关特征。

二、组织培养模型

组织培养模型主要包括巨噬细胞、树突状细胞和肺泡上皮细胞模型。组织培养模型常用于研究细胞在分子水平上的发病机理，主要包括结核分枝杆菌与感染细胞之间的相互作用以及结核分枝杆菌感染时细胞内信号通路等。

1.巨噬细胞模型

由于结核分枝杆菌是胞内菌，主要感染巨噬细胞，因此，巨噬细胞是最常用的细胞模型，主要用于早期感染阶段的研究。巨噬细胞常用于分枝杆菌野生株和突变菌株的毒力分析，以及其与结核分枝杆菌相互作用机理的研究。巨噬细胞可能来源于人或鼠，既可以是原代细胞，也可以是传代细胞系，原代细胞更接近于体内情况。由于缺乏标准化的检测试剂，除了小鼠的巨噬细胞外，其他动物的巨噬细胞并不常用。小鼠巨噬细胞可以从骨髓或冲洗肺组织中分离得到。

有许多小鼠巨噬细胞系可供选择，包括现在广泛使用的J774系细胞和RAW 264.7细胞。使用鼠源巨噬细胞，有检测试剂容易获得等许多优点。此外，原代巨噬细胞可从基因敲除小鼠制备，这样，在细胞水平上可对特定宿主与结核分枝杆菌之间的相互关系进行研究。如通过加入IFN-γ和肽聚糖，使小鼠原代巨噬细胞系活化，研究诱导型一氧化氮酶（NOS）的变化情况。NOS可催化NO的产生，进而研究活化的巨噬细胞杀灭结核分枝杆菌所必需的NO含量变化情况。

人类巨噬细胞也被广泛应用，实验中所用人类巨噬细胞主要来源于可分化为巨噬细胞的人外周血单核细胞（MDMs）的初代培养物，或来源于支气管洗液（但不易分离）。通过在转化的单核细胞系如THP-1中加入巴豆油酯，其可分化为巨噬细胞样的吞噬细胞。THP-1细胞系和可传代细胞系U937都是常用的细胞系。研究表明，分化的THP-1细胞对结核分枝杆菌感染的反应同MDMs相似。用于人巨噬细胞对结核分枝杆菌感染反应的检测研究试剂容易获得。

巨噬细胞用作细胞模型有其局限性。首先，某些分枝杆菌突变株在巨噬细胞内并不能表现出致弱的表型，而用小鼠研究时表现出生长缺陷且引起较轻微的组织学病变，这样，只使用巨噬细胞选择或筛选毒力表型时就可能漏掉一些结核分枝杆菌突变株表型。其次，从同一动物的不同组织中分离的巨噬细胞对结核分枝杆菌感染的反应可能不同。最后，不同鼠来源的巨噬细胞对结核分枝杆菌的敏感性存在差别。

2.树突状细胞模型

树突状细胞（Dendritic cell, DC）是专门将抗原递呈给T细胞的一类细胞，是最有效的抗原递呈细胞，在启动先天性免疫中具有核心作用。它们来源于骨髓，但最近的研究表明，它们也可能来源于骨髓样或淋巴样前体细胞。树突状细胞具有将结核分枝杆菌在感染部位抗原捕获后迁移到淋巴结，激活幼稚淋巴细胞的能力。树突状细胞表达大量的递呈分子如MHCⅡ类分子和共刺激分子如CD40和CD86。树突状细胞以一个精细的网络存在于气道黏膜表面，其与结核分枝杆菌的相互作用在抗结核免疫反应中起着重要作用。

体外证据表明，树突状细胞能吞噬结核分枝杆菌，细菌被摄取后，树突状细胞的功能和表型发生改变。人树突状细胞和结核分枝杆菌的相互作用引起细胞成熟和活化，成熟活化的细胞其表型和细胞因子表达谱改变。结核分枝杆菌感染和BCG感染的树突状细胞，IL-12、IL-6、TNF-α、IL-1的表达上调。这些细胞因子在抗结核免疫保护反应中起重要作用。

Ludovic等（2003年）研究发现，新分离的人树突状细胞表达DC-SIGN受体（一种树突状细胞特异性的细胞内黏附分子-3，人免疫缺陷病毒HIV也与该受体结合），结核分枝杆菌与人单核细胞来源的DC-SIGN受体结合后，进入细胞内，并且在结核病人淋巴结CD14-HLA-DR＋DC-SIGN＋细胞内检测到结核分枝杆菌的成分，因此，DC-SIGN受体介导的结核分枝杆菌进入树突状细胞内可能影响细菌的持续存在和宿主免疫反应。

3.肺细胞模型

尽管结核分枝杆菌以气溶胶的形式进入肺组织后主要侵入巨噬细胞，Bermudez（1996年）体外研究发现，结核分枝杆菌到达肺泡后能侵入Ⅱ型肺泡上皮细胞。因此他提出，细菌侵入Ⅱ型肺泡上皮细胞与肺部感染结核分枝杆菌的发病机制存在联系，肺泡上皮细胞为结核分枝杆菌的定居和感染创造了条件，避免了巨噬细胞可能的杀灭作用。

Tomioka（2003年）证实，Ⅱ型肺泡上皮细胞作为体外抗结核药物活性分析模型，在预测药物的治疗作用和抗菌活性方面具有重要的应用价值。

表1-2　3种结核分枝杆菌感染研究中常用组织培养模型特性比较

注：“＋”的数量表示各种动物模型显示各项特征的相关程度，“-”表示无相关特征。

三、小结

以上提到的结核分枝杆菌实验模型各有其特点，在阐明结核分枝杆菌毒力基因、细菌在宿主内持续存活的机理以及新型药物、疫苗、诊断试剂评价方面起着重要的作用。研究者可利用每种模型特定的特点解决结核分枝杆菌研究中困难复杂的问题，通过探索，加深我们对结核分枝杆菌这种复杂病原的认识，并发现预防和治疗结核病的新方法。