反向系列探针杂交技术

第六节　反向系列探针杂交技术

核酸杂交技术根据检测目的和方法的不同，可分为液相杂交、固相杂交及细胞内定位（原位）杂交。固相杂交又可分为斑点杂交、印迹转移杂交。这类杂交技术的特点是将酶切产物或PCR扩增片断直接点膜或经电泳后Southern转移固定至膜上，与液相中标记的特异探针杂交，这种杂交模式称为正向分子杂交。应用该法检测待检样品时，一次反应仅能与一种探针杂交，多用于检测样品中有无需扩增的靶基因。如要对多个耐药基因的多个突变位点同时进行鉴定，则需与多种探针一一杂交反应，繁琐而费时，难以满足临床检测要求。将一系列包括分枝杆菌属、群、种特异的寡核苷酸探针固定于膜或微孔板上，与液相中待检标记的PCR产物杂交的模式被称为反向分子杂交。 1989年，Saiki等首次结合PCR扩增并应用反向斑点杂交（reverse dot blot，RDB）方法，即PCR-反向斑点杂交（ PCR-RDB）技术同时检测全血中β地中海贫血多种基因突变位点，使β地中海贫血基因突变诊断取得了飞跃式进展。由于PCR-反向斑点杂交技术操作相对简便、快速，且价格相对低廉，因而已经在临床检测中应用于基因分型、基因突变检测和病原微生物菌种鉴定等领域。根据探针点样形态和阵列的不同，该技术也可区分为反向系列探针杂交或线条探针杂交（line probe assay，LiPA）技术。

反向系列探针杂交技术原理是：预先将特定的寡核苷酸探针排列固定于固相载体上，采集待检标本，提取基因组DNA或RNA，应用生物素修饰的特异引物扩增DNA或反转录扩增RNA，使PCR产物带有生物素标记，将PCR产物变性后与固定在膜上的特异寡核苷酸探针杂交，通过酶免疫显色法检测和判读杂交结果。Rossau应用Innogenetics公司开发的检测结核分枝杆菌耐RFP基因型的试剂盒，通过反向杂交试验检测107例已知rpoB序列的结核分枝杆菌分离株4种突变类型和264株通过传统药敏试验检测的临床分离株，检测灵敏度为98%，特异性为100%。

Watterson等则对包括线条探针技术在内的三种分子耐药技术应用于临床分离株、痰标本和支气管灌洗液（BALF）的rpoB基因突变位点的检测，结果表明，对于临床分离株线条探针技术、错配碱基扩增技术和噬菌体扩增技术的突变检出率分别为100%（16/16）、93.8%（15/16）和100%（16/16）；对于临床痰标本和BALF，线条探针技术、错配碱基扩增技术突变检出率分别为94.7%（36/38）和100%（38/38）。噬菌体扩增技术不能直接对临床标本进行检测。目前，国外已应用该技术开发了检测与RFP耐药相关突变的商品化试剂盒，商标名为INNO-LiPA Rif。该试剂盒以rpoB基因为检测靶序列，设计了5个（S1～S5）探针与结核分枝杆菌野生型rpoB基因广泛杂交，4个用于鉴定下列4种常见突变的R探针：R2,Asp516Val； R4a,His526Tyr； R4b,His526Asp； R5, Ser531Leu及1个结核分枝杆菌复合群鉴别探针。该试剂盒能将检测和鉴定结核分枝杆菌复合群与检测该菌株RFP药物敏感性同时进行。目前的研究表明，与传统药物敏感性检测方法和rpoB测序技术相比较，该试剂盒检测与RFP耐药有关的突变，敏感性为92%～98%，特异性为100%。目前已报道应用的商品化的试剂盒，多限于检测rpoB基因。但能同时检测RFP和INH耐药的试剂盒最近也已有报道。

研究结果显示，反向系列探针杂交技术在临床结核杆菌快速耐药检测中具有广阔的应用前景。与目前常规的实验室鉴定方法和其他分子鉴定方法相比，具有明显优势。首先，它可以在一次实验中同时对多种耐药基因的多种基因位点进行快速基因型别鉴定，具有检测信息量大的特点。其次，它可以直接对临床痰标本进行检测，而目前的噬菌体扩增技术尚不能直接对临床标本进行检测。因此，实验室常规的结核杆菌药敏检测时间可以从目前的4～6周缩短至6个小时，真正能起到指导临床医生及早准确用药的作用。另外，同DNA序列测定和最近几年发展的DNA芯片技术相比，反向系列探针杂交技术不需昂贵的仪器设备，所以，更具有在临床实验室应用的潜力。然而，国外已推出的结核杆菌耐药基因检测系统由于价格仍然较昂贵，目前仅限于发达国家临床实验室及研究之用。因此，研制开发适合在发展中国家临床实验室开展使用的新型反向系列探针杂交技术尤为必要。