-限制性片段长度多态性分析

第四节　PCR-限制性片段长度多态性分析

不同种属细菌间的差异，其本质是DNA水平上核苷酸序列存在差异，这种差异可影响限制性内切酶的切割位点。DNA分子片段经限制性内切酶消化后，进行琼脂糖凝胶电泳分析，不同分枝杆菌酶切片段的数量或大小不同，电泳图谱呈现多态性，分析其差异，可对分枝杆菌菌种进行鉴定。早期应用染色体DNA进行RFLP分析来鉴定菌种，但由于电泳后条带杂乱，结果分析较困难。PCR-RFLP通过先用分枝杆菌属特异性引物对标本DNA进行扩增，再经RFLP分析来鉴定菌种。

Vaneechoutte等对分枝杆菌属特异的16SrDNA片段PCR扩增，所得DNA片段（1500bp）经Cfo I、Mbo I、Rsa I酶消化，电泳分析酶切谱型可对分枝杆菌进行鉴定。 1998年，Sansila等用特异性更强的16SrRNA-23SrRNA ITS引物扩增380bp片段，经HaeⅢ酶切后，结核分枝杆菌复合群和鸟分枝杆菌、胞内分枝杆菌均产生特征性谱型，经MspⅠ消化后能鉴别胞内分枝杆菌和瘰疬分枝杆菌。Telenti等应用PCR扩增hsp65的一段基因片段（439bp），并用BstEⅡ和HeaⅡ酶切消化分析34种分枝杆菌，显示出不同分子量的带谱图谱。Devallois等也应用PCR-RFLP对常见分枝杆菌进行分析，均产生可鉴别的带型，该方法可鉴别最常见的致病性分枝杆菌。显示了该技术结合hsp65编码基因非常适合分枝杆菌的鉴别诊断。此外，Niemann等对gyrB DNA序列扩增出1020bp的片段，用3种限制性酶酶切，可以将结核分枝杆菌复合群区分开。

用PCR-RFLP的技术关键在于选择合适的引物和限制性内切酶，以尽可能鉴定出常见的致病分枝杆菌。本技术方法相对简便易行、快速准确，然而由于电泳受多种因素影响，难于规范和统一试验条件，不适宜产业化。