第一节 牛结核分枝杆菌培养技术要求
一、目的
明确牛结核分枝杆菌培养试验的标准化、规范化操作。
二、适用范围
所有操作牛结核分枝杆菌的实验人员。
三、职责
操作牛结核分枝杆菌的实验人员必须取得ABSL-3实验室准入的资质证明，有责任保护环境和他人的生命安全，有义务接受生物安全管理委员会和室主任的监督。
四、场所
所有的加液、移液、洗涤、离心管盖拧开与拧紧都应在生物安全三级实验室生物安全柜内进行。
采用防气溶胶密闭式水平离心机离心，在生物安全柜时，任何物体表面都应保持不受污染，若有污染应用3%石炭酸或其他可靠消毒液表面消毒处理。
所有的废弃标本、污染物（包括洗涤液）均应收集于含消毒液，并套有耐高温高压塑料袋的容器中。实验完毕后将塑料袋口扎紧连同容器一起一并进行高温消毒。
五、程序
进入实验场所之前，要事先准备好所需试剂、样品。查看前一位实验者是否已经清场，是否有记录。确认实验区已消毒后，带入已消毒物品，登记，进入实验区。
1.培养基的制备
（1）土路豆（Trudeau）培养基。
①成分：马铃薯甘油浸液330ml、卵黄300ml、卵白30ml、1%孔雀绿水溶液13ml。
②制法：
a.将马铃薯洗净去皮，称取100g，绞碎后加入8%甘油水溶液500ml，置15磅高压蒸汽30分钟，取出后滤出其上层马铃薯甘油浸出液330ml供用。
b.用肥皂洗净鸡蛋外壳，浸泡于75%酒精中30分钟，取出，用无菌镊子打开蛋壳，将蛋黄和蛋白分开，分盛于无菌玻璃瓶内，振荡摇匀。取蛋黄300ml与蛋白30ml，加于上述马铃薯甘油浸液330ml内。
c.摇匀，再加入1%孔雀绿水溶液13ml，再行混合，用无菌纱布过滤，分装于标准螺旋盖培养管或灭菌试管中，每管7ml，加热使凝固成斜面。用间歇灭菌法灭菌。培养基斜面应占试管的2/3。
d.制成的培养基斜面应表面光滑，有一定韧性和酸碱缓冲能力。
e.制成的培养基37℃无菌试验24小时，检查培养基污染情况后置4℃避光保存，1个月内使用。
（2）改良罗氏培养基。
①成分：谷氨酸钠（纯度99%以上）7.2g、磷酸二氢钾（KH2PO4）14.0g、硫酸镁（MgSO4· 7H2O）0.24g、柠檬酸镁0.6g、丙三醇12ml、马铃薯淀粉30g、蒸馏水60 ml、新鲜全卵液1000ml、2%孔雀绿水溶液20ml。
②制法：
a.基础液制备：量取蒸馏水600 ml，加入各无机盐成分、谷氨酸钠和丙三醇，溶解后加马铃薯淀粉，混匀，沸水浴1小时使呈糊状（不时摇动，防凝块），冷却。
b.新鲜鸡卵液制备：洗净新鲜鸡卵表面，浸泡在70%乙醇或其他稀释消毒液中20～30分钟。取出，擦干，开口，收集鸡卵液，搅匀。通过消毒的纱布过滤成鸡卵液。
c.将600 ml基础液和1000 ml新鲜鸡卵液混匀。加入2%孔雀绿水溶液20 ml，混匀，静置1小时后，分装至标准螺旋盖培养管或灭菌试管中，每管7ml。用间歇灭菌法灭菌。培养基斜面应占试管的2/3。
d.制成的培养基斜面应表面光滑，有一定韧性和酸碱缓冲能力。
e.制成的培养基37℃无菌试验24小时，检查培养基污染情况后置4℃避光保存，1个月内使用。
③其他商品化培养基。
a.按商品说明，溶解、分装、灭菌，制备成固体斜面培养基，4℃避光保存备用。
b.也可按说明溶解、灭菌，制备成液体培养基，4℃避光保存备用。
2.样本接种前去污染处理
（1）痰标本：视样本性，通常取2～4ml，盛于离心管中，加入1～2倍体积4%氢氧化钠（NaOH）消化液，拧紧离心管盖，摇振5～10分钟，使痰液充分匀化，室温放置。自加入氢氧化钠消化液起，整个处理时间应在15～20分钟。然后滴加5%～10%盐酸液中和，使混悬液变为淡黄绿色为止（ pH值约6.8）。最后以1600r/min～1800r/min离心20～30分钟，取沉淀物用作镜检和分离培养及动物接种。样本数较多时，应分批处理。
（2）其他样本：尿液、胃或支气管灌洗液等可能污染样本可参照痰样本处理方法。血液、脑脊液、纯培养物等无污染样本，无需作去污染处理。
3.接种和培养
（1）接种操作应在生物安全三级实验室生物安全柜内进行。固体斜面培养基常用于临床标本细菌的分离培养、菌种保存、药物敏感试验等，液体培养基用于纯培养物增菌、药物敏感试验及其他特殊用途。
（2）用吸管吸取去污染后的标本0.1ml，均匀接种在整个培养基斜面，临床标本每份应接种2支斜面培养基，纯培养物转种视实验要求而定。
（3）接种后斜面向上，于37℃环境中平放24小时后，检查培养基污染情况，然后直立放置，37℃继续培养。
4.结果观察
（1）对于固体斜面培养基，于接种后第3、第7天各观察一次菌落生长情况。发现菌落生长者，临床标本培养时经抗酸染色证实后，可视为快速生长分枝杆菌阳性。此后每周观察一次，记录菌落生长及污染情况。阳性生长物经抗酸染色证实后，可视为分枝杆菌生长。满8周后未见菌落生长者视为培养阴性。分离培养出的分枝杆菌需进一步作菌种鉴定。
（2）观察时发现非分枝杆菌生长时，应视为其他细菌污染。临床标本培养污染率应在2%～5%范围内。污染率过高，提示培养基灭菌不佳，标本前处理、接种等环节有误，应当分析原因，采取相应措施。
5.清场
填写实验室和仪器使用记录和清场记录，内容如下：
清场记录（是画√，否画×）
（1）是否将带毒物品进行消毒处理。（ ）
（2）生物安全柜是否填写使用记录。（ ）
（3）生物安全柜用后是否消毒。（ ）
（4）恒温培养箱是否填写温度记录。（ ）
（5）实验室其他仪器工作状态是否填写使用记录。（ ）
（6）实验废弃物是否消毒处理。（ ）
6.可能危害
结核病牛胸水、脑脊液、支气管灌洗液淋巴细胞，在进行样品处理过程中可能被结核病菌污染；样品称重时，如直接在天平上称量，会污染天平，造成感染性物质在实验室内的扩散；在无菌研钵中用研槌研磨，制备成悬液，如操作不慎，易发生悬液外溢，导致病料污染实验台面；弃去的拭子、使用过的研钵如果不及时放入消毒袋中经高压处理或没有及时放入消毒液中浸泡再高压处理，也易污染实验台面；在研磨和捣碎的操作中均可产生气溶胶，如不加以适当防护，易增加吸入感染的可能性；样品在离心过程中，如离心管有裂纹，未加以仔细检查，离心时不平衡造成离心管破裂等，样品从离心管中溢出，污染离心机。在上述情况下，易发生病料泄漏，造成实验室环境污染和实验人员感染。
7.应急措施
在进行样品处理过程中，为避免气溶胶的产生和病原体扩散并感染实验操作人员，所有操作应在生物安全柜中进行，实验人员着三级个人防护用品；样品必须在密封的容器内称重；样品在无菌研钵中用研槌研磨时，应小心操作，在预先铺好的消毒纸巾上研磨，一旦发生外溢，及时用消毒纸巾擦拭消毒；弃去的拭子、使用过的研钵及时放入消毒袋中经高压处理或及时放入消毒液中浸泡再高压处理；如发生标本收集管破裂，应停止实验，先用一块布或纸巾盖上，再把消毒剂倒到上面，至少静置30分钟，然后才可把布和纸巾及打碎的物品清理走。玻璃碎片应用镊子夹取，污染区应用消毒剂拖干净。如离心过程中发生收集管破裂，应关闭电源并且保持离心机盖子关闭30分钟。如果在机器停止运行后发生了破裂，离心机盖应立即关闭并保持30分钟，并及时通知实验室生物安全员。
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