第二节 牛结核分枝杆菌抗酸染色法技术要求
一、目的
明确牛结核分枝杆菌抗酸染色法试验的标准化操作。
二、适用范围
所有操作牛结核分枝杆菌的实验人员。
三、职责
操作牛结核分枝杆菌的实验人员必须取得ABSL-3实验室准入的资质证明，有责任保护环境和他人的生命安全，有义务接受生物安全管理委员会和室主任的监督。
四、场所
所有的加液、移液、洗涤、离心管盖拧开与拧紧都应在生物安全三级实验室生物安全柜内进行。
采用防气溶胶密闭式水平离心机离心，在生物安全柜时任何物体表面都应保持不受污染，若有污染应用3%石炭酸或其他可靠消毒液表面消毒处理。
所有的废弃标本、污染物（包括洗涤液）均应收集于含消毒液，并套有耐高温高压塑料袋的容器中。实验完毕后将塑料袋口扎紧，连同容器一起一并进行高温消毒。
五、程序
实验人员在进入实验场所之前，要事先准备好所需试剂、样品。查看前一位实验者是否已经清场，是否有记录。确认实验区已消毒后，带入已消毒物品，登记，进入实验区。
1.涂片的制备
此步骤应在生物安全三级实验室生物安全柜内完成。
（1）涂片：各种标本涂成1.5cm×l.5cm大小。一张载玻片只可涂抹一份标本。载玻片经95%乙醇擦拭脱脂，干燥、清洁、无油污、无划痕，涂片前于玻片背面的左端1/3处用油性标记笔编号。载玻片最好只使用一次。
（2）痰标本涂片制备：
①直接涂片法。用接种环或专用竹签挑取标本的脓样、干酪样部分0.05～0.1 ml，于载玻片正面的右侧2/3中央处均匀涂抹成椭圆形痰膜。
②集菌涂片法。
漂浮集菌法：取深咳痰或12～24小时痰液经121.3℃高压灭菌15分钟，待冷后，取0.5～1ml盛于体积为10ml的玻璃容器中（口径约2cm），加灭菌蒸馏水2ml，总体积勿超过容器的1／3，加二甲苯0.03ml，放入振荡器振荡10分钟，取出，加蒸馏水至满瓶口，将已编号的载玻片盖于瓶口上，静置20分钟，取下载玻片。
离心集菌法：取深咳痰或12～24小时痰液经121.3℃高压灭菌15分钟，待冷后，取0.5～1ml盛于体积为50ml的离心管中，加水至5ml，经6000r/min～8000r/min离心20分钟后，小心蘸取离心沉渣少许作涂片。
（3）其他标本涂片制备：脑脊液、尿液、胃或支气管灌洗液等标本涂片制备。各种标本先以6000r/min～8000r/min离心20分钟后，小心蘸取离心沉渣少许作涂片。
细菌纯培养物涂片制备。将细菌液体培养物直接涂于载玻片上；或先在载玻片上添加一接种环生理盐水，再取细菌固体培养物与生理盐水磨匀，取菌量不可太多，使盐水磨成灰白色即可。
2.干燥
涂片最好在室温下自然干燥。
3.固定
干燥后的标本片以涂有标本的一面朝上，迅速通过火焰3次，这样既可杀菌，又能将细菌固定在载玻片上，以免载玻片上的细菌在染色过程中被水冲洗掉。
4.染色方法
（1）齐—尼氏染色法：将涂片平放于染色缸上方的支架上（注意要放平以免染色液倾泻），滴加石炭酸复红液，稍多加，以淹没涂布区，染色5分钟后用水冲洗。以3%盐酸酒精充分脱色，随即用水冲洗。再用吕氏美兰染1分钟，用水冲洗，待干，在油镜下检查。
（2）厚片法：本法特点是制作涂片时较普通涂片厚3～4倍，染色时，用亚硫酸钠溶液代替美蓝，染3～5分钟，其余方法与一般抗酸法相同。本法优点为检出阳性率高。
5.结果观察
（1）油镜的识别：油镜头上都有标记，标有100×；镜头前端有黑色、白色或红色的圆圈；刻有“III”或Oil等，其入光孔径也较其他物镜小。
（2）油镜的使用（观察细菌的形态）：将显微镜平稳地安放在实验台适宜处。以天然光线为光源时，使用平面反光镜；以灯光为光源时，使用凹面反光镜。把集光器升到最高位置，把光圈完全打开，增大射入光线的强度。接着将标本固定在载物台上，先把低倍镜调至视野最亮，并找到标本视野的适当位置，然后换用油镜。先在玻片上滴香柏油1滴，用眼从侧方看着物镜，缓慢转动粗调节器，使物镜头浸于油镜内，并几乎与载玻片接触为止，但勿使两者相碰，防止损伤镜头或载玻片。然后从目镜视察，仔细转动粗调节器，看到模糊物像时，再调动细调节器，使物像清晰，未能看到物像时，可重复上述操作。
（3）染色结果：牛结核分枝杆菌为抗酸菌，被染成红色；非抗酸菌及其他组织细胞被染成蓝色。
6.废弃标本、污染物及操作工作面的处理
痰瓶（盒）、废弃标本、培养物等污染物，均需经高压蒸汽灭菌后才能丢弃或清洗，严禁不经灭菌随意处理。将痰瓶（盒）等标本置于一搪瓷盘中，在生物安全柜内进行涂片操作。操作完毕后将盘与废弃物等置于含消毒液并套有耐高温高压塑料袋的容器中，一并进行高压蒸汽灭菌。
标本操作工作面的消毒：生物安全柜操作面以3%石炭酸或其他可靠消毒液擦拭后，再以紫外线照射30分钟。
7.清场
填写实验室和仪器使用记录和清场记录，内容如下：
清场记录（是画√，否画×）
（1）是否将带毒物品进行消毒处理。（ ）
（2）生物安全柜是否填写使用记录。（ ）
（3）生物安全柜用后是否消毒。（ ）
（4）恒温培养箱是否填写温度记录。（ ）
（5）实验室其他仪器工作状态是否填写使用记录。（ ）
（6）实验废弃物是否消毒处理。（ ）
8.各种抗酸染色液的配制
（1）石炭酸复红液：碱性复红酒精饱和溶液10ml、6%石炭酸90ml。
（2）3%盐酸酒精：浓盐酸3ml、95%酒精97ml。
（3）吕氏美蓝液：美蓝酒精饱和溶液30ml、氢氧化钾（1∶10000）100ml。
（4）亚硫酸钠溶液配制：5%无水亚硫酸钠400ml、95%酒精100ml。
9.应急措施
在进行样品处理过程中，为避免气溶胶的产生和病原体扩散并感染实验操作人员，所有操作应在生物安全柜中进行，实验人员着三级个人防护用品。样品应放置在预先铺好的消毒纸巾上，一旦样品悬液滴落在实验台面上，应及时用消毒液进行处理。小心吸取和稀释样品悬液，尽量减少气溶胶的产生；另外，实验产生的废弃物应收集在盛有消毒液的容器内，防止废弃物对实验室环境的污染。
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