第四节牛结核分枝杆菌的动物

第四节　牛结核分枝杆菌的动物 接种试验技术要求

一、目的

明确牛结核分枝杆菌动物接种试验的标准化操作。

二、适用范围

所有操作牛结核分枝杆菌的实验人员。

三、职责

操作牛结核分枝杆菌的实验人员必须取得ABSL-3实验室准入的资质证明，有责任保护环境和他人的生命安全，有义务接受生物安全管理委员会和室主任的监督。

四、场所

所有的加液、移液、洗涤、离心管盖拧开与拧紧都应在生物安全三级实验室生物安全柜内进行。

采用防气溶胶密闭式水平离心机离心，生物安全柜内任何物体表面都应保持不受污染，若有污染，应用3%石炭酸或其他可靠消毒液表面消毒处理。

所有的废弃标本、污染物（包括洗涤液）均应收集于含消毒液，并套有耐高温高压塑料袋的容器中。实验完毕后将塑料袋口扎紧连同容器一起一并进行高温消毒。

五、程序

1.实验动物的准备

实验动物的准备、麻醉、解剖和尸体处理等参见《兽医实验室生物安全管理规范（农业部，2003年）》。接种样品的准备参见第一节“牛结核分枝杆菌的培养试验”样品处理部分。样本接种前要进行去污染处理。

（1）痰标本：视样本性，通常取2～4ml，盛于离心管中，加入1～2倍体积4%氢氧化钠（NaOH）消化液，拧紧离心管盖，摇振5～10分钟，使痰液充分匀化，室温放置。自加入氢氧化钠消化液起，整个处理时间应在15～20分钟。然后滴加5%～10%盐酸液中和，使混悬液变为淡黄绿色为止（pH值约为6.8）。最后以1600r/min～1800r/min离心20～30分钟，取沉淀物用作镜检和分离培养及动物接种。样本数较多时，应分批处理。

（2）其他样本：尿液、胃或支气管灌洗液等可能污染样本可参照痰样本处理方法。血液、脑脊液、纯培养物等无污染样本，无需做去污染处理。

2.用于分离结核杆菌的动物接种试验流程

（1）接种剂量及部位：通常用豚鼠做试验，将经集菌处理的病料悬液注入豚鼠的腹股沟皮下，每只1～1.5ml，每份病料接种2～3只。如果病料中含结核杆菌，豚鼠在接种后2周对结核菌素产生变态反应阳性。因此，可在接种后3～4周，用1∶20结核分枝菌素和牛分枝菌素以及禽分枝菌素各0.1ml分别皮内注射豚鼠。

（2）结果观察：若豚鼠感染牛分枝杆菌或结核分枝杆菌，那么，在注射部位出现明显的红肿反应，经72小时仍不消退；而对禽分枝杆菌素仅产生轻微反应，持续24～48小时就消失。若豚鼠感染禽分枝杆菌时，则对禽分枝杆菌素产生强烈反应，而对结核分枝杆菌素和牛分枝杆菌素仅有轻微反应或无反应。可借此区分病料中结核分枝杆菌的种类，但对人结核分枝杆菌或牛分枝杆菌还需进一步经致病力检测进行鉴别。试验豚鼠一般在接种病料后3周开始于注射局部发生溃疡，区部淋巴结肿胀。

（3）剖检：如接种后4～6周仍不死亡，可将其剖检观察病理变化。当感染结核分枝杆菌或牛分枝杆菌时，可见肝、脾和局部淋巴结形成结核结节病灶，肺在发病晚期也有病变，肾一般无病灶。如果感染的是禽分枝杆菌，则主要在注射局部产生脓肿和在邻近局部淋巴结形成结节病灶。从病灶组织中可镜检到典型抗酸性菌和分离到结核杆菌。对结核菌素反应阴性的豚鼠应于接种后第6周剖检1只，8～12周再剖检1只。如被检材料来源于禽，即疑为有禽分枝杆菌时，可在接种豚鼠的同时，再接种鸡或家兔，10周内可使这两种动物死亡，在肝和脾上见有结核病灶。

3.用于致病力分种的动物试验

（1）动物接种：先将被检菌按其重量制成一定浓度的悬液，注射量以菌液中菌体重量计算。家兔耳静脉注射0.01mg菌体，鸡翅静脉注射1mg菌体，豚鼠皮下注射1mg菌体以作对照。

（2）结果观察：若被检菌株为牛分枝杆菌，家兔将在接种后5周内死于急性结核病；禽分枝杆菌对兔的毒力低，一般在注射后10周死亡；而结核分枝杆菌用上述剂量不会使家兔死亡。家兔感染牛或禽分枝杆菌时，主要在肾、脾、肝和肺产生明显病灶。鸡感染禽分枝杆菌时，可在10周内死亡，但人工接种结核分枝杆菌或牛分枝杆菌不引起感染。豚鼠注射牛分枝杆菌时通常在6～8周内死亡，而结核分枝杆菌皮下注射10～13周内才使豚鼠死亡。根据3种动物的试验结果可鉴定被检菌属于何种菌。但一般认为，鉴别结核杆菌的种别最好根据分离物的培养特性（包括生化特性）和对动物的致病力试验综合加以判定。

六、污染物及动物尸体的处理

痰瓶（盒）、废弃标本、培养物等污染物，均需经高压蒸汽灭菌后才能丢弃或清洗，严禁不经灭菌随意处理。将痰瓶（盒）等标本置于一搪瓷盘中，在生物安全柜内进行涂片操作。操作完毕后将盘与废弃物等置于含消毒液并套有耐高温高压塑料袋的容器中，一并进行高压蒸汽灭菌。

动物尸体需套入耐高温高压塑料袋的容器中，一并进行高压蒸汽灭菌。

七、应急措施

在注射过程中，用注射器和针头时有发生锐器意外刺伤的可能，同时存在被动物咬伤的可能。在此情况下，受伤人员应脱去保护服，洗净双手和受伤部位，用75%的乙醇消毒创伤处，及时送急救室，告知医生受伤的原因及所污染的微生物，征求并遵守医生的建议，并将受伤及治疗情况归档。如离心过程中发生收集管破裂应关闭电源并且保持离心机盖子关闭30分钟。如果在机器停止运行后发生了破裂，离心机盖应立即关闭并保持30分钟，并及时通知试验室生物安全员。