第二节 显微镜检查
检查牛分枝杆菌临床样品和组织材料涂片可用显微镜直接观察。病料涂片后进行抗酸染色，显微镜检查抗酸性杆菌，本菌的细胞壁不仅有肽聚糖，还有特殊的糖脂，因为糖脂的影响，致使革兰氏染色不易着色，能抵抗30ml/L盐酸酒精的脱色作用，抗酸染色为红色，常用齐—尼氏（Ziehl-Neelson）染色法，也可用荧光抗酸染色法。如果组织内有抗酸性微生物，并且具有典型的组织学病变，则可以做出初步诊断。抗酸染色法阳性率比较低，但它作为一种传统的检测方法，具有假阳性率低，价格低廉，操作简便等特点，在牛场中就可进行，所以，仍有一定的实用价值。
一、齐—尼氏抗酸染色液配制方法
1.苯酚复红染色液
碱性复红饱和酒精溶液（100ml 95%酒精中加3g碱性复红）10ml，5%苯酚溶液90ml，二者混合后用滤纸滤过。
2. 3%盐酸酒精脱色液
浓盐酸3 ml，95%酒精97 ml，混匀。
3.骆氏美蓝染色液
甲液：美蓝0.3 g，95%酒精30ml。
乙液：0.01%氢氧化钾溶液。
将甲、乙两液相混合。
二、涂片操作步骤
1.涂片
涂片自然干燥后，放置在染色架上，载玻片间距保持在10mm以上；火焰固定（在5秒钟内将玻片置于火焰上来回烘烤4次）。
2.染色
滴加石碳酸复红染液，火焰加热至出现蒸汽后，脱离火焰，保持染色5分钟。染色期间应始终保持染色部位被染色液覆盖，必要时可续加染色液。加温时勿使染色液沸腾。
3.冲洗
流水自载玻片一端轻缓冲洗，冲去染色液，沥去标本上剩余的水。
4.脱色
自上端外缘滴加脱色剂布满载玻片，脱色1分钟；如有必要，需流水洗去脱色液后，再次脱色涂片无可视红色为止。
5.清洗
流水自载玻片一端轻缓冲洗，冲去脱色液，沥去载玻片上剩余的水。
6.复染
滴加亚甲蓝复染液，染色30秒钟。
7.清洁
流水自载玻片一端轻缓冲洗，冲去复染液，沥去标本上剩余的水。待载玻片干燥后镜检。
要求：一张染色合格的涂片，由于被亚甲蓝染色而呈亮蓝色。将染色后的载玻片放置在报纸上，如果报纸上的文字透过涂层不能被看清，表明该玻片涂抹过厚。
三、镜检步骤
1.读片
使用10倍目镜双目显微镜读片。
2.调焦
取染色完毕且已干燥的载玻片，向上放置在玻片台上并以卡尺固定。首先使用40倍物镜，转动卡尺移动至玻片左端，将光线调节至适当亮度，调节焦距至可见细胞形态；移开40倍物镜，在载玻片上滴1～2滴镜油，使用100倍油镜进行细致观察。在淡蓝色的背景下，抗酸菌呈红色，其他细菌和细胞呈蓝色。为防止抗酸杆菌的交叉污染，严禁镜头直接接触载玻片上的液体。
3.读片方法
首先应从左向右观察相邻的视野；当移动至玻片一端时，纵向向下转换一个视野，然后从右向左观察，依此类推。通常10mm×20mm大小的部位，使用100倍油镜，每行可观察100个视野，观察3行则约为300个视野。仔细观察完300个视野，一般至少需要5分钟以上。一位镜检人员连续阅读10～12张载玻片后应休息约20分钟。
4.分枝杆菌的基本形态
直接进行涂片镜检时，能够发现不同种的分枝杆菌形态。结核分枝杆菌多数为杆状、稍弯曲；菌体宽度0.3～0.6μm；菌体长度不一，长0.5～8μm，多数在1.5～3.5μm。含结核分枝杆菌较多的新鲜标本经齐—尼氏染色后，100倍油镜观察，可见单个存在的，也能看到聚集成簇或分枝状排列的菌体；染色良好的组织标本，可见菌体内着色较深的异染颗粒。
四、镜检结果报告与登记
涂片镜检的结果报告，不仅对牛结核病的诊断提供依据，报告的数量也一定程度上反映了疾病严重程度和传染性的大小。涂片镜检结果的登记应按照镜检结果的分级报告标准登记在结核病细菌学实验室登记本上。不能只填写阴性、阳性或（-）、（＋）等。
五、齐—尼氏染色镜检结果分级报告标准
抗酸杆菌阴性（-）：连续观察300个不同视野未发现抗酸杆菌。
报告抗酸杆菌菌数：1～8条/300视野。
抗酸杆菌阳性（1＋）：3～9条/100视野。
抗酸杆菌阳性（2＋）：1～9条抗酸杆菌/10视野。
抗酸杆菌阳性（3＋）：1～9条抗酸杆菌／每视野。
抗酸杆菌阳性（4＋）：≥10条抗酸杆菌／每视野。
六、抗酸染色玻片的处理
看完齐—尼氏染色玻片后，应立即用浸满二甲苯（分析醇）的擦镜纸揭取数次，彻底去除玻片上的镜油。经脱油干燥后的玻片，按实验室序号及涂片编号放置在玻片盒中，存放在阴凉干燥的环境中，以备复检或质控抽检。
涂片抗酸染色检查要注意预防假阳性和假阴性结果的产生。假阳性是指将阴性涂片错误判读为阳性，假阴性是指将阳性涂片错误判读为阴性。属于技术因素的影响要通过一系列实验室内和实验室间的质量控制不断改善。
七、假阳性结果的预防措施
必须使用新的载玻片进行涂片检查。
每个标本均使用一个新竹签完成制片涂抹。
所有染液均经过过滤。
染色时玻片之间保持一定距离，相互彻底分隔开。
严禁使用染色缸将玻片放置在一起染色。
染色时勿使玻片上的染液干燥。
滴加镜油时，严禁容器滴口直接接触玻片。
严禁物镜镜头直接接触玻片。认真按照要求读片，准确记录和报告结果。
完整准确地标注玻片和实验室登记本的各项内容。
登记前、后对检验单和标本盒上的标注进行仔细核对。
八、假阴性结果的预防措施
确认每份标本至少有3 ml。
选择脓样、干酪样、黏液分泌物涂抹制备玻片。
制备玻片时标本涂抹均匀，不要太厚或太薄。
使用高质量染料，严格按照配方配制染液。
严格按照操作程序完成染色过程。
判断结果为“阴性”前，必须观察规定的视野数。
作为对照，可采用已知结果为阳性的玻片，完成染色镜检过程。
完整、准确地标注玻片和实验室登记本。
登记前对检验单和标本盒上的标注进行仔细核对。
准确记录和报告结果。
九、玻片的保存
镜检后的涂片应及时用浸满二甲苯的擦镜纸彻底去除涂片上的镜油。
再次核对实验室登记本与每张涂片实验序号。
严禁在涂片上标记镜检的阴性、阳性结果。
按实验室登记本序号连续排列全部涂片，存放于玻片盒内。
涂片保存与实验室登记本记录应保持一致。
保存近3个月的全部组织涂片待各级实验室质量控制抽检，如果年涂片量不足500张，必须全部保存。
装满涂片的玻片盒，需用标签注明涂片实验序号区间和日期区间，以便日后盲法复检或现场评价时抽样。
十、显微镜日常维护
显微镜作为发现阳性涂片的重要设备，实验室工作人员应正确使用并给予正确维护，以保证其正常工作和延长使用寿命。在使用和维护显微镜时应特别遵守下列要点。
显微镜应放置在干燥、无尘和通风的环境中。如果显微镜一段时期内停止使用，应拆开并放置在原包装盒内，并放置有效的干燥剂。
使用前和使用后必须使用擦镜纸彻底清洁物镜。
严禁物镜镜头直接接触玻片上的液膜。
使用油镜时，只能使用细螺旋调节焦距。
使用电光源显微镜时，注意电压和电流是否与仪器要求相匹配。
十一、镜检要求
防止抗酸杆菌的交叉污染，严禁油镜头直接接触涂片上的染色部位。
仔细观察300视野，不少于10分钟。
每个工作日，一名镜检人员的涂片阅读量不应超过25张。
连续阅读10～12张涂片后，应休息20分钟左右。
十二、载玻片要求
新载玻片应经95%乙醇脱脂，检查无划痕后方可使用。
一张载玻片只能涂抹1份标本。
载玻片只允许一次性使用，不得清洗后重复使用。
载玻片正面左侧1/3处用玻璃刻刀笔标记实验序号。
载玻片正面右侧2/3中央处均匀涂抹成面积为1.0mm×2.0mm的卵圆形液膜。
十三、染色要求
肉眼观察染色后的液膜应呈均匀淡蓝色，无红色斑块。
染色后的涂片放置在报纸上，如果文字透过液膜不能被看清，表明该涂片涂抹的太厚。
染色后的液膜脱落部分应小于整个涂抹面积的10%。
免责声明：以上内容源自网络，版权归原作者所有，如有侵犯您的原创版权请告知，我们将尽快删除相关内容。
