第三节 牛结核分枝杆菌的培养
血液或乳汁等样品,由于含菌量较少,如直接涂片镜检往往是阴性结果。此外,在培养或做动物试验时,常因污染杂菌生长较快,使病原结核分枝杆菌被抑制。下列几种浓缩方法可使检验标本中蛋白质溶解、杀灭污染杂菌。而结核分枝杆菌因有蜡质外膜而不死亡,从而得到浓缩。
一、消化法
1.硫酸消化法
用4%~6%的硫酸溶液将组织、尿、粪或病灶组织等按1∶5的比例混合,然后置37℃培养箱中作用1~2小时,经3000r/min~4000r/min离心30分钟,弃去上清液,取沉淀物涂片镜检、培养和接种动物。也可用硫酸消化浓缩后,在沉淀物中加入3%氢氧化钠中和,然后涂片镜检、培养和接种动物。
2.氢氧化钠消化法
取氢氧化钠40g,钾明矾2g,溴麝香草酚蓝20mg(预先用60%酒精配制成0.4%浓度,应用时按比例加入),蒸馏水1000ml混合,即为氢氧化钠消化液。
3.安替福民沉淀浓缩法
溶液A:碳酸钠12g、漂白粉8g、蒸馏水80ml。
溶液B:氢氧化钠15g、蒸馏水85ml。
应用时,A、B两液等量混合,再用蒸馏水稀释15%~20%,制成安替福民溶液,该溶液须存放于棕色瓶内。将被检样品置于试管中,加入3~4倍量的安替福民溶液,充分摇匀后37℃作用1小时,加1~2倍量的灭菌蒸馏水,摇匀,3000 r/min~4000 r/min离心20~30分钟,弃去上清液,沉淀物加蒸馏水恢复原量后再离心一次,取沉淀物涂片镜检、培养和接种动物。
二、操作方法
1.方法一
将被检的组织、尿、粪便或病灶组织用氢氧化钠消化液按1∶5的比例稀释混匀后,37℃作用2~3小时,然后无菌滴加5%~10%的盐酸溶液进行中和,将pH值调到6.8左右(此时显淡黄绿色),以30000r/min~4000r/min离心15~20分钟,弃去上清液,取沉淀物涂片镜检、培养和接种动物。
2.方法二
在病料中加入等量的4%氢氧化钠溶液,充分振摇5~10分钟,然后用30000r/min离心15~20分钟,弃去上清液,加1滴酚红指示剂于沉淀物中,用2mol/L盐酸中和至淡红色,然后取沉淀物涂片镜检、培养和接种动物。
3.方法三
在组织液或小脓块中加入等量的1%氢氧化钠溶液,充分振摇15分钟,然后用30000r/min离心30分钟,取沉淀物涂片镜检、培养和接种动物。
4.方法四
对组织液的消化浓缩也可采用以下较温和的处理方法:取1mol/L(或4%)氢氧化钠水溶液50ml,0.1mol/L柠檬酸钠50ml,N-乙酰-L-半胱氨酸0.5g,混合。取组织1份,加上述溶液2份,作用24~48小时,以30000r/min离心15分钟,取沉淀物涂片镜检、培养和接种动物。
为了除去分枝杆菌以外的其他微生物,将组织样品置于加了酸或碱,如5%草酸或2%氢氧化钠匀浆缸内制成匀浆。不过,根据具体情况,也可采用其他浓度的化学药品去污,混合物于室温振荡10分钟,然后中和。悬浮液以30000r/min~50000r/min离心15分钟,弃去上清液,沉淀物上层用于培养和显微镜检查。在确诊以前,组织样品-20℃保存。
初步分离是将沉淀物接种于一套含鸡蛋的分离用固体培养基上,如Lowenstesin-Jensen,Coletsos和Stonebrink氏培养基,分别加丙酮酸钠或甘油或两者都加(每种1~2支斜面),或接种到琼脂培养基上,如Middlebrook 7H10或7H11培养基。
培养物在37℃含或不含CO2环境下至少孵育8周,培养基应放入密封管中,以防干燥。斜面于第1、第3、第5和第7周或更长时间观察其生长情况,将可见的生长物制备涂片,按齐—尼氏技术染色。一般看来,分离牛分枝杆菌的最好培养基是含有丙酮酸钠,不含甘油的Stonebrink氏培养基。牛分枝杆菌一般孵育3~5周后方可生长。
如果培养基发生污染,或样品检查为阴性,而眼观及组织病理学检查结果为阳性,那么,应用所推荐样品重复培养。冻结组织处理后至少接种豚鼠2只。去污染的沉淀物重溶于少量磷酸缓冲液,于后腿股部肌注0.5ml,4~5周后,用80国际单位(IU)禽结核菌素和80IU牛结核菌素试验。注射后24小时,测量硬结直径。如皮肤试验为阳性,便做解剖检查,收集异常淋巴结和其他组织做分离培养。如果为阴性,4~6周后重新做试验。
将疑为分枝杆菌的生长物用鸡蛋培养基和Middlebrook 7H10或吐温白蛋白肉汤作继代培养,孵育到可见生长物出现。有些实验室,接种之前先加无菌牛胆汁,可以促进菌块分散。
三、意外事故的处理
如果发生意外,必须立即通知实验室主管人员,并在有关人员的指导监督下对出事现场进行处理,绝对禁止未经报告而私自对出事现场给予非规范的处理。
实验过程中,如污染物溅落到身体表面,或有割伤、刺伤、烧伤、烫伤等情况发生,应立即停止实验工作进行紧急处理,更换被污染的实验服,皮肤表面用消毒液清洗,伤口用碘酒或酒精消毒,眼睛用无菌生理盐水冲洗。
如果发生菌液溢出,含菌种的培养管破碎等,造成中、小面积污染,可用比污染面积大25%以上的纱布覆盖污染区域,边缘用脱脂棉围住,向纱布倾倒5%苯酚溶液或70%的酒精,浸泡2小时以上(其间适量加溶液防止干燥),再经紫外灯近距离(1米内)照射2小时以上;被污染的器械、容器等立即浸泡于70%酒精中2小时以上,实验完成后再进行高压消毒处理。
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