助细胞超微结构变化特点

6.1.2　助细胞超微结构变化特点

枸杞胚囊细胞中结构最复杂、变化最大的是助细胞。助细胞不仅结构复杂，而且从其发生、发育到退化、解体，细胞质发生了一系列巨大变化。目前普遍认为，助细胞在胚囊营养物质的吸收与向化性物质和酶的分泌上起着不可替代的作用。具体表现在助细胞的分泌活动与引导花粉管在子房内的定向生长有关。有研究认为，吸引花粉管生长的向化性物质可能直接通过丝状器流出（如矮牵牛），或是通过助细胞扩散出酶，引起珠孔附近的组织产生向化性物质。助细胞还具有接受花粉管内容物和促使雄性配子进入到卵和中央细胞的作用。而助细胞的细胞壁和丝状器的结构特点，使得助细胞在控制雄配子进入胚囊和细胞间信息交流方面发挥了重要作用。

图6-3　双受精前卵核与次生核靠近且“受精靶区”细胞器丰富

图6-4　“受精靶区”的线粒体、核糖体、囊泡等丰富

6.1.2.1　助细胞分化早期超微结构特点

枸杞助细胞的细胞化起始时间与卵细胞几乎同步进行。八核胚囊形成后，紧靠珠孔端，两个从位置上看靠在一起的、同源核的胞质迅速增加，最初形成了两个既无细胞壁也无细胞膜的裸细胞。裸细胞呈楔形紧靠在一起塞满了胚囊的珠孔端，并且靠珠柄侧的一个助细胞胞质中具有形状不规则的电子密度很大的物质。放大后可见电子密度大的助细胞胞质中光滑内质网、线粒体和脂质囊泡非常丰富。另一个远珠柄侧的助细胞胞质中线粒体和粗糙内质网异常丰富，并且在这个助细胞的上端（合点端）已经出现了大液泡的分化（见图6-5）。这种助细胞在细胞尚未形成时胞质成分就出现了很大的差异现象尚未见有报道。两个助细胞的这种分化差异是否与所处位置有关？换句话说，是否因位置上的差异造成了细胞分化上的差异？这种在助细胞早期分化时就已经出现的差异是否成为将来一个助细胞定向受精的基础，到目前为止尚未见到有关报道。

作者对助细胞这种早期分化过程中胞质组成上出现的差异现象较为感兴趣，并且这种分化差异似乎与“位置效应”有关，一个较接近卵核，靠珠柄侧；另一个远离卵核。作者认为，胚囊中的8个核的细胞分化与其存在的位置有关，而且据胡适宜的观点，在胚囊成熟过程中，核的定位对细胞的决定是一个重要因素，也佐证了作者的观点。

在两个助细胞胞质出现差异时，两个助细胞间的细胞壁尚未开始分化，也未见丝状器的出现，助细胞靠胚囊处的质膜和细胞壁正在分化之中，并且可以见到与其相邻的珠被绒毡层正在向助细胞分泌构建细胞壁的结构物质。

而此时，卵细胞的质膜核细胞壁正在分化之中，可以看到这些构建质膜和细胞壁的物质是由中央细胞大液泡运输过来的小泡及其附着颗粒物与卵细胞胞质中的核糖体和粗糙内质网组建而成（见图6-6）。卵细胞的大液泡是由卵细胞的胞质包裹一部分胚囊中央的液泡后形成的。卵细胞这时斜着位于助细胞的上端，细胞核及大部分细胞质呈马蹄形，偏向珠孔端的珠柄侧，分布在珠柄侧的助细胞的上方。而大液泡偏向远珠柄侧，也分布于珠柄侧的助细胞的上方。

图6-5　两个助细胞分化早期，其裸细胞胞质组成上的差异

图6-6　分化中的卵细胞质膜与细胞壁

接着两个助细胞分化成形，但是其细胞壁仍在分化之中，细胞核与核仁均比较大，位于助细胞的中部。两个助细胞彼此紧紧地靠在一起，形态犹如姐妹细胞，胞质密度很大，在胞质中具有很丰富的线粒体和粗糙内质网等细胞器。然而，卵细胞的合点端未见细胞壁的分化（见图6-7）。

图6-7　分化中的助细胞与卵细胞

之后不久，两个助细胞与卵细胞一起分化成熟，与卵细胞在珠孔端排列成品字形。此时，两个助细胞的形态、结构一样，没有差别，细胞核较靠近合点端，且核膜波浪状凸凹不平。大液泡位于靠合点的一侧。细胞质中含丰富的线粒体、粗面内质网和高尔基体，质体数量较少，线粒体为球形或棒状,集中分布于珠孔端丝状器的附近，大液泡周围细胞器较稀少。并且细胞在其细胞核以上的合点端没有细胞壁，仅存留一层质膜，而且靠珠柄侧的助细胞在靠极核稍下方的质膜出现了异常，质膜膨胀且不连续（见图6-8和图6-9）。推测可能是花粉管释放精细胞的区域，与受精作用有关。

在珠孔端核细胞化过程中，合点端的反足细胞也在分化之中。最后分化形成的反足细胞较卵器的细胞小。此时，反足细胞靠合点端具有细胞壁，而靠珠孔端及相邻细胞间没有细胞壁，仅为质膜包裹，与卵器结构一样。

卵器成熟时，助细胞的丝状器也分化完成。

丝状器是助细胞位于珠孔端基部两细胞间细胞壁向内剧烈增厚、延伸后形成的不规则片状突起，纵切面观近扇形，其基部较宽，顶部逐渐变窄并入细胞壁中。该突起类似传递细胞的内褶壁，所以大大地增加了助细胞质膜的表面面积。据研究，丝状器主要由果胶质、半纤维素及纤维素等组成，其作用使助细胞犹如传递细胞一样，在受精过程中能分泌某些物质诱导花粉管进入胚囊，同时还可能分泌某些酶物质，使进入胚囊的花粉管末端溶解，促进精子和其他内含物质注入胚囊，以及具有吸收、贮藏和转运珠心组织的物质进入胚囊的作用。丝状器的形成被认为是助细胞发育成熟的最后一个特征。已有研究表明，丝状器在不同植物中有不同的形态，但是在同一个科内外形变化不大。

6.1.2.2　成熟助细胞超微结构特点

助细胞分化成熟时，两个助细胞的形态、结构未见有什么区别，细胞呈楔形，紧紧靠在一起，大液泡较小，靠合点端分布，胞质较密，占据了细胞大部分体积，靠珠孔端分布，两个细胞核对称分布于助细胞中上部位，核膜不平整呈波浪状，丝状器横切面观呈长带状，分布于助细胞的珠孔端。此时的助细胞仍然具有极性特征。

图6-8　助细胞分化成熟时，细胞分布、形态及结构特点

图6-9　受精靶区助细胞超微结构特点及丝状器形态

放大后观察，可见细胞器集中分布于细胞核的周围，其中核糖体、线粒体、质体、高尔基体、粗糙内质网很丰富，并且线粒体和质体形态较大，呈各种形状。丝状器对称分布于两个助细胞基部的内侧。在助细胞基部的胚囊入口处，具有很多的分泌囊泡。助细胞的细胞壁很薄，并且在与胚囊相邻的细胞壁内侧具有大量的内陷囊泡。除此之外，在靠珠柄侧助细胞中上端部位“受精靶区”没有细胞壁，仅由膨胀、松散的质膜将助细胞胞质与中央细胞的胞质分割开来。在受精的靶区区域线粒体、核糖体、高尔基体、质体以及小泡较多（见图6-10）。

图6-10　“受精靶区”助细胞的质膜结构

所以，从细胞器的分布及类型看，助细胞的代谢活动很旺盛，细胞壁很薄，并且具有直接从胚囊吸收营养物质的能力。此外，在受精的靶区，助细胞没有细胞壁，仅有膨胀、松散的质膜阻隔助细胞与中央细胞的胞质。这样，精子被释放后，很容易就能穿过这层松散的质膜进入到靶区。因此，助细胞具有进行受精作用的精细结构条件。

6.1.2.3双受精时助细胞的超微结构特点

观察发现，花粉管进入胚囊时，助细胞基部的胞质和丝状器没有多大的变化，而且花粉管并不是直接进入到助细胞中，而是穿过丝状器前端的分泌物，绕过丝状器的顶端，在与胚囊壁相邻的靠近珠柄侧的助细胞的表面穿行，然后在助细胞的中上端细胞壁消失的部位进入助细胞。花粉管进入助细胞后顶端破裂，随即释放出两个精子和花粉管内容物。经观察，在助细胞分化成熟时，靠近珠柄侧助细胞的中上端细胞壁消失，仅有裸露的质膜，且质膜松散，而且此区域直接与卵核和次生极核相邻。所以，精子很容易地穿过助细胞松散的质膜，进入到受精靶区。而且花粉管内容物的性质具有很强的脂质特征，电子密度很大，并且不均匀地分布于管腔中。由于切面角度的关系，尚不能证明花粉管直接进入到了哪个助细胞。但是从胚囊位置来看，花粉管进入到了近珠柄侧的助细胞。

此时，助细胞中部的胞质电子密度很大，脂质性质非常强，其中布满了似脂质性质的囊泡，其中分布着很多线粒体，而且助细胞顶端的大液泡已经基本消失，在大液泡所在部位，两个助细胞贯通连成了一体，其中含有丰富的线粒体、核糖体、粗糙内质网、高尔基体、脂质小滴以及较多的小液泡。此外，在助细胞中部电子密度很大的胞质上方，出现了较多的似脂质小泡组成的脂质团。该脂质团放大后可见，里面密布着大量的短的细丝（见图6-11）。

这些短的细丝与助细胞中部胞质中的似脂质囊泡里的成分，以及丝状器的成分非常相似。这时卵细胞已经受精，并且卵核很大，核质非常致密（见图6-12）。

6.1.2.4　受精后助细胞超微结构特点

双受精作用结束后，两个助细胞的脂质团迅速增多，同时细胞上端胞质变形，下端及丝状器开始液泡化，出现了退化、解体迹象，胞质中出现了大量的小泡，这些小泡由大量单膜围成的消化囊泡组成。在退化过程中，未见两个助细胞有什么差异。退化助细胞下端胞质插入胚囊珠孔端基部将丝状器包围。最后助细胞萎缩，在二细胞原胚阶段解体（见图6-13和图6-14）。

图6-11　助细胞上端的似脂质团超微结构

两个助细胞中，一般有1个助细胞较早地退化，这已被公认是实现受精不可缺少的环节，但是，在枸杞助细胞中，两个助细胞受精前后没有出现明显的退化现象，似乎不合常理。然而，在助细胞发育过程中，一开始就呈现出了明显的胞质分化现象，是否已经表明二者在受精过程中的差异？或者说一个助细胞退化并非是受精过程必不可少的环节。

但是，两个助细胞的胞质在受精后仍然发生了很大变化，胞质分化成了明显的两个部分，其中绝大部分的胞质电子密度很大，位于助细胞下部丝状器的一端，而一小部分胞质的电子密度较低，位于电子密度很大的胞质的上方、大液泡的边缘，并且在大液泡中出现了很多小泡。进一步放大后发现，电子密度很大的胞质中含有丰富的脂质囊泡，以及线粒体和膨大的光滑内质网，其顶部电子密度较低的物质就是由这些脂质囊泡分泌形成的，只有较强的脂质性质的肠状脂质团。此外，在丝状器顶端胚囊入口处，由丝状器分泌形成的分泌物均匀且整齐，呈纤维状均匀分布，并且在靠珠柄侧的分泌物表面有一些电子密度大的物质。丝状器完整、发达，其中较均匀地分布着一些电子密度大的小颗粒。传粉后花粉管到达胚囊之前，两个助细胞的结构出现差异。花粉管尚未到达胚囊的两个助细胞仍然维持结构完整及代谢活跃的状态，出现的一些变异主要是管状内质网明显增加，染色较深，核的结构尚完整，大多数细胞器仍可辨认，但结构有些模糊。说明两个助细胞已趋向退化的状态。

图6-12　花粉管进入胚囊时助细胞超微结构特点

图6-13　受精后助细胞与卵细胞的超微结构特点

图6-14　受精后助细胞超微结构变化特点

据研究，助细胞退化和以下3个方面的作用有关：①引导花粉管进入胚囊。以往很多的研究表明，花粉管进入胚囊前，一个特定助细胞先行发生退化，之后花粉管进入退化的助细胞释放出两个精子细胞。这种现象不仅在珠孔受精时如此，即使在合点受精与中部受精的场合也同样如此。②促进花粉管释放精子。花粉管进入退化细胞以后不久即停止生长，管尖破裂，将精子和其他内含物释放到退化助细胞中。所以，退化的助细胞具有促进花粉管释放精子的作用。③帮助实现精子的转移。精子被释放以后，随着花粉管与助细胞的细胞质转移到退化的助细胞的合点端。由于助细胞退化后质膜解体，精子可以无阻碍地进入受精的靶区。

但是，在枸杞中，不论是花粉管进入胚囊前，还是受精作用发生时，均未观察到助细胞退化现象，而且在受精作用结束之后，两个助细胞同时发生退化、解体。这种现象与以往研究结果有很大的出入，也令作者百思不得其解。如果说是因为切片角度的缘故，观察不到退化助细胞的正面的话，那么细胞质的结构应该多少存在着差异。但是，作者观察了很多个胚珠切片，均未看到在花粉管进入胚囊前某个助细胞退化的情况。反倒是注意到在助细胞分化早期出现的胞质组成上的差异现象。另外，在观察花粉管进入助细胞时，发现会有多个花粉管进入胚囊的现象，但是只有靠珠柄侧的助细胞接受了花粉管，而从远珠柄侧的助细胞进入的花粉管在助细胞表面穿行的过程中因受阻而解体，其花粉管内容物遗留在了助细胞的基部。再加上受精作用结束后，两个助细胞呈现相同的退化现象，所以，作者推测助细胞的退化可能不一定是花粉管进入胚囊的前提，反而是由于“位置效应”的结果，只有靠卵细胞的助细胞（即靠珠柄侧的助细胞）在受精的靶区具有精致的质膜结构。因此，只有这个靠卵细胞的助细胞才能接受花粉管，完成受精作用。而且从花粉管穿行的距离来看，只有通过靠卵细胞侧的助细胞，才是最短的穿行距离。因此可以得出，由于“位置效应”的作用决定了哪个助细胞对受精作用具有重要意义。

目前，已在一些植物中发现助细胞退化具有“位置效应”，尽管目前尚未肯定助细胞本身存在着决定是否退化的异型性，但在另一方面，至少一部分植物中，由于两个助细胞在胚珠中处所的位置不同，它们在退化的倾向性方面有所差异。

根据近20年对20多种植物所做的超微结构研究，助细胞退化的时间也因植物而异，大致包括以下三种情况：第一种情况是授粉前助细胞已经退化，迄今仅小麦和水稻中观察到这种现象。第二种情况是助细胞退化发生在授粉后至花粉管达到胚囊前这一段时间。多数已研究的材料属于这种类型。第三种情况，花粉管进入助细胞后导致其退化，有少数几种植物属于这种类型。

助细胞退化大多发生于授粉后42～48小时，即花粉管进入子房而尚未达到胚囊之前。如果不授粉或授粉后36小时以前切断花柱，阻止花粉管进入子房，则助细胞不退化。

另外，在助细胞中，最突出的特征是其珠孔端细胞壁上有丝状器结构。在早先对棉花等植物研究后，大多数学者认为助细胞具有提供营养作用的功能，它通过丝状器从珠心吸收营养，运输到卵和中央细胞，供其生长发育。但是，也有学者认为助细胞仅限于分泌向化性物质，对花粉管定向生长起诱导作用。但是本研究结果倾向于两者兼并。从枸杞助细胞的超微结构特征可以看出，其助细胞的代谢活动十分活跃，并具传递细胞的特征，在物质吸收和分泌作用中起着重要的作用。尤其是在受精前后，对花粉管的定向引导、受精后早期胚发育的营养供应具有至关重要的作用。

从雌性生殖单位结构来看，由于很少观察到胞间连丝，所以雌性生殖单位细胞之间的联络，主要通过质外体途径进行。