菌种的生产技术

（四）菌种的生产技术

1.母种生产技术

（1）母种培养基制作

①常用母种培养基配方：如表3-7所示。

表3-7　常用母种培养基

②母种培养基制作：以1000毫升PDA加富培养基制作为例，详注如下：

a.配制营养液。马铃薯去皮、挖眼，切成丝状或黄豆粒大小的块；将麸皮、玉米面、黄豆粉提前用清水调成糊状；电饭锅内加入1100毫升清水，待水开后放入切好的马铃薯和麸皮、玉米面、黄豆粉，煮15～20分钟，期间不停搅拌，至马铃薯酥而不烂为宜。用四层纱布过滤，取滤液并定容至1000毫升；琼脂称好后用剪刀剪成1厘米长的小段，并提前用清水浸泡泡软；待马铃薯过滤好后，将琼脂放入滤汁中继续加热至完全融化；撤除热源，趁热加入葡萄糖、磷酸二氢钾、硫酸镁和维生素B₁，并迅速搅拌。

b.分装营养液。营养液制好后趁热分装，可用20毫升注射器或漏斗、橡胶管等装置。20毫米×200毫米试管注入10毫升，18毫米×180毫米试管注入8毫升营养液。期间注意不要让营养液沾污管口。分装量为试管总容积的1/5。

c.塞棉塞。分装完后，待培养基凝固且管壁内无冷凝水，即可塞棉塞。棉塞松紧要适度，且最好不用潮湿旧棉塞。棉塞长度为试管长度的1/5，2/3于管中，1/3于管外。塞好棉塞后，7～10支为一捆，然后用防潮纸包好试管口。

d.高压灭菌。将包好的培养基试管装入高压灭菌锅内，于121～125℃灭菌30～40分钟。培养基内营养成分越丰富越应延长灭菌时间。灭菌结束后，待指针归零，打开锅盖留出小缝隙，利用锅内余热将包扎的纸和棉塞烘干后即可取出试管。

e.摆斜面。灭菌的培养基趁热摆放，斜面长度为试管长度的1/2～2/3，最好用棉被覆盖使其缓慢降温，以防管壁内形成大量冷凝水。

（2）母种转管扩繁

①接种前准备：斜面母种、待接试管斜面培养基、酒精棉球、火柴、油笔、气雾消毒剂、标签纸、接种镐、酒精灯、培养皿、镊子整齐有序地放入超净工作台或接种箱中备用。超净工作台在接种操作前40分钟开启风机和紫外线灯，达到时间后，关闭紫外线灯、风机照开，暗光30分钟后即可接菌；接种箱用苯酚或来苏尔进行空间喷雾，再以气雾消毒剂熏蒸40分钟后使用。

②消毒处理：依次用75%的酒精棉球将双手、接种台面、培养皿、接种工具和母种试管外壁表面消毒。也可用1%～2%碘伏进行消毒，效果较好。消过毒的工具放于培养皿上，不要再乱放。

③火焰处理：点燃酒精灯，用镊子将培养皿先进行灼烧，再将接种工具利用酒精灯火焰灼烧灭菌，之后放培养皿上晾凉待用。

④火焰无菌区接种：左手持母种试管，在酒精灯火焰无菌区，用右手的小指、无名指取下试管棉塞，用火焰封住管口，用接种钩将母种斜面前端0.5厘米弃去，拿工具挑着母种试管，用左手平行并排拿起待接斜面培养基，斜面均向上，管口要齐平。在火焰无菌区，用小指和手掌取下待接试管的棉塞，将试管口在火焰上稍微烧一下，以杀灭管口上的杂菌，随后用接种铲取火柴头大小菌种块迅速移入待接试管培养基斜面中部，再利用酒精灯外焰烧一下试管口，同时微燎棉塞塞住管口。再挑着母种试管接下支空白试管，如此反复操作，1支母种可扩接50～80支继代母种。接种结束后，及时清理干净接种台面。

⑤贴标签：接好种的继代母种，逐支贴上标签，写明接种人、菌种名称、接种日期、转管次数等。

⑥母种培养、检查：接好种的继代母种，放入25～28℃的恒温培养箱内，闭光培养。通常7～10天长满斜面。培养初期要及时检查，个体间长速差异明显，长速变缓、出现异常色素和杂菌菌落的菌种试管及时淘汰。

（3）母种鉴定、保藏

①优良母种的基本特征：优良母种常常表现为菌丝生长整齐，同批试管间菌丝的生长外观没有明显的差异，菌丝长速正常，符合该品种的特有形态特征，菌落边缘外观整齐、长势旺盛。

②不良母种的基本特征：母种退化、老化的表现为菌丝长速减慢，同批母种个体间长速差异明显，生长状态呈现多样性，甚至有的菌种转接后出现杂菌菌落。

2.原种生产技术

（1）原种培养基制作

①常用原种培养基类型：

a.谷粒类培养基：最主要的是麦粒培养基需小麦98%、石膏粉2%，适宜于蘑菇、平菇、香菇、黑木耳、杏鲍菇等菌丝的生长。

b.高粱粒培养基：高粱粒98%、石膏粉2%，适宜于平菇、香菇、灵芝、猴头、金针菇等菌丝的生长。

c.木屑类培养基：一种是阔叶树木屑78%、麸皮（或米糠）20%、蔗糖1%、石膏粉1%，含水量55%～60%，适宜于平菇、香菇、灵芝、黑木耳、滑菇、猴头、杏鲍菇、金针菇、大球盖菇等菌丝的生长；另一种是小松木块65%、松木屑14%、米糠18%、蔗糖2%、石膏1%，含水量60%～65%，适宜于茯苓等菌丝的生长。

d.玉米芯类培养基：玉米芯78%，麸皮20%、蔗糖1%，石膏粉1%，含水量65%，适宜黑木耳、平菇、鸡腿菇、杏鲍菇等菌丝生长。

e.棉子壳类培养基：棉子壳78%、麸皮20%、蔗糖1%、石膏粉1%，含水量60%～65%，适宜于大多数食用菌菌丝的生长。

f.秸秆类培养基：一种是麦秸74%、麸皮25%、石膏1%，适宜于鸡腿菇、大球盖菇、平菇、蘑菇等菌丝生长；另一种是玉米秆碎段78%、麸皮20%、石膏1%、石灰1%，适宜于鸡腿菇、平菇等菌丝生长。

g.混合培养基：一种是木屑45%、蔗渣40%、米糠10%、过磷酸钙2%、蔗糖1%、石膏粉2%，含水量65%，适宜于平菇、香菇、黑木耳等菌丝的生长；另一种是木屑40%、棉子壳38%、麸皮15%、玉米粉3%、豆饼粉2%、石膏粉1%，蔗糖1%，含水量60%左右，适宜金针菇、平菇、香菇等菌丝生长。

②常用原种培养基制作程序。

a.谷粒类培养基制作流程如图3-3所示。

图3-3　谷粒类培养基制作流程

●谷粒挑选：选择新鲜、无霉变、无虫蛀、完整的谷粒。

●谷粒浸泡：根据谷粒的大小、含水量、环境温度等确定谷粒的浸泡时间；麦粒、高粱粒通常浸泡0.5～1天，玉米粒浸泡1～2天，夏天浸泡时间可适当缩短，同时为防止变酸可添加适量石灰。谷粒泡至内部吸水充分为宜。

●谷粒煮制：将泡好的谷粒放于沸水中煮至无白心即可，切不可煮得时间过长而导致谷粒破裂。煮好后捞出，于纱布上沥干水分。

●装瓶（袋）：将沥干水分的谷粒内拌入石膏，混匀。之后将其装入750毫升或500毫升罐头瓶或高压聚丙烯袋中，装量占空间的一半，之后擦净瓶口，拿高压聚丙烯膜封口；塑料袋则要系紧袋口上端。

●灭菌、接种：将谷粒培养基于高压灭菌锅内121～125℃灭菌2～2.5小时。之后于干净无菌处冷凉，当温度降至25℃以下则可接种。接种要在无菌环境下迅速接完。

●培养、检查：接种后的菌种放于25℃洁净环境中遮光培养，发现污染及时挑出。当菌丝于表层长至料的1/3处时，要对菌种瓶（袋）进行摇晃，使带有菌丝的谷粒均匀布满菌种瓶（袋），这样可缩短菌种满袋天数。

b.代用料培养基制作流程如图3-4所示。

图3-4　代用料培养基制作流程

●培养料预处理：所用原料选择新鲜干燥、无霉变、无虫蛀的原料，使用前最好经过阳光暴晒1～2天。木屑通常要经过预湿、堆积，待吸水充足、散尽不良气味后使用；玉米芯也要提前预湿；秸秆类原料通常要先破坏秸秆外层蜡质层，之后也要提前预湿；棉子壳由于吸水较快，不必提前预湿。

●拌料：将主辅料混匀，溶水性的营养物质溶于水中加入，边拌边加，一定要将培养料充分混匀，否则易造成接种后菌丝生长不匀。同时培养料含水量要符合标准，不能过低或过高。

●装瓶：将拌好的培养料闷堆1～2小时，之后将其装入750毫升或500毫升罐头瓶中，装量至罐头瓶瓶肩处压紧实，拿打孔椎于料面中部打眼之后擦净瓶口，用高压聚丙烯膜封口。

●灭菌：将培养基于高压灭菌锅内121～125℃灭菌1.5～2小时，或在常压灭菌锅内100℃灭菌8小时以上。灭菌时间根据环境中杂菌数量、装瓶数、季节等确定。

●冷却、接种：将灭菌后的培养基于干净无菌处冷凉，当温度降至25℃以下则可接种。接种要在无菌环境下迅速接完。

●培养、检查：接种后的菌种放于25℃洁净环境中遮光培养，发现污染及时挑出。规模化生产时，可2天检查一次，一般待菌丝封住瓶口并向下生长1厘米后，则不易发生污染。

（2）原种接种

①接种前准备：待接母种、待接原种培养基、酒精棉球、火柴、油笔、气雾消毒剂、标签纸接种镐、酒精灯、培养皿、镊子整齐有序地放入超净工作台或接种箱中备用。超净工作台在接种操作前40分钟开启风机和紫外线灯，达到时间后，关闭紫外线灯、风机照开，暗光30分钟后即可接菌；接种箱或接种帐用苯酚或来苏尔进行空间喷雾，再以气雾消毒剂熏蒸40分钟后使用。

②消毒处理：依次用75%的酒精棉球将双手、接种台面、培养皿、接种工具和母种试管外壁消毒。消过毒的工具放于培养皿上，不要再乱放。

③火焰处理：点燃酒精灯，用镊子将培养皿先进行灼烧，再将接种工具利用酒精灯火焰灼烧灭菌，之后放培养皿上冷凉待用。

④火焰无菌区接种：一般需2～3人接种。一人左手持母种试管，在酒精灯火焰无菌区，用右手的小指、无名指取下试管棉塞，用火焰封住管口，用接种镐将母种斜面前端0.5厘米弃去，之后拿工具将母种斜面平均割成5～6段。在火焰无菌区，用接种镐迅速将割好的母种块接入待接原种培养基穴内，拿原种培养基的人要注意在酒精灯火焰无菌区打开封口膜，同时要原种瓶口迎接母种试管口，不能反向。如此反复操作，1支母种可扩接5～6瓶待接原种培养基。接种结束后，及时清理干净接种台面。

⑤贴标签：接好种的原种培养基，逐瓶贴上标签，写明接种人、菌种名称、接种日期等。

⑥原种培养、检查：接好种的原种放入25～28℃的恒温培养箱内或培养架上，暗光培养。通常25～30天长满原种瓶。培养初期要及时检查，个体间长速差异明显、长速变缓、出现异常色素和杂菌菌落的菌种及时淘汰。

（3）原种鉴定、保藏

原种接种后第3天，即应开始进行检查。正常的原种应生长整齐，相同品种长速一致，色泽洁白，无绿色、灰绿色、暗褐色、橘红色、灰白色、黑灰色等杂菌菌落颜色，菌丝丰满、浓密、均匀，菇香味浓郁，无酸臭味和酒精味。具备以上特征的原种才是优良菌种。

长满的原种应及时使用。若不及时使用则应在5～10℃条件下保藏，在高温条件下，尽量缩短存放时间，否则会影响菌丝活力。

3.栽培种生产技术

（1）栽培种培养基制作

①常用原种培养基类型：栽培种培养基制作配方可参考原种培养基制作配方。但在栽培种培养基制作配方中可将麸皮、稻糠的用量调至10%～15%，而增加主料的量。栽培种的主料宜选用混合型基质，以满足菌丝多种营养的需求。

②常用栽培种培养基制作程序如图3-5所示。

图3-5　常用栽培种培养基制作程序

a.培养料预处理：所用原料选择新鲜干燥、无霉变、无虫蛀的原料，使用前最好经过阳光暴晒1～2天。木屑通常要经过预湿、堆积，待吸水充足、散尽不良气味后使用；玉米芯也要提前预湿；秸秆类原料通常要先破坏秸秆外层蜡质层，之后也要提前建堆、预湿；棉子壳由于吸水较快，不必提前预湿。

b.拌料：将主辅料混匀，溶水性的营养物质溶于水中加入，边拌边加，一定要将培养料充分混匀，否则易造成接种后菌丝生长不匀。同时培养料含水量要符合标准，不能过低或过高。目前市场上的拌料机设备基本可以满足拌料的标准，但使用过程中一定要严格监控加水量。

c.装袋：将拌好的培养料闷堆1～2小时，之后将其装入（15～18）厘米×（33～35）厘米×（0.04～0.045）厘米的高压聚丙烯塑料袋或低压聚乙烯塑料袋，装量为每袋干料量0.5～0.75千克，做到松紧适宜、有弹性感、装袋四周均匀。目前市场上的装袋机一人操作，可同时供5～7人系袋。系袋有如下几种方法：直接拿线绳系紧成活扣；或将袋口套上套环和无棉盖体；或是将袋口套上套环，插入塑料锥形棒，再将暴露出的袋口系紧。还有其他封袋口方法，此处不一一叙述。

d.灭菌：由于栽培种数量很多，所以通常我们应用周转筐将栽培种移至常压灭菌锅（房）内。周转筐若为铁制品，则要在框架上缠裹布条；塑料周转筐则要刮掉筐璧内尖锐的塑料渣，以防装袋过程中扎破袋壁。周转筐在锅内应摆放整齐，筐与筐之间留有缝隙以便蒸汽流通。常压灭菌锅应在100℃灭菌8小时以上，锅内冒出大气、排尽锅内冷空气后开始计时。灭菌时间根据环境中杂菌数量、装袋数量、季节等确定。

e.冷却、接种：冷却室内提前以高锰酸钾水拖地，环境喷洒苯酚、二氧化氯等消毒水，并提前1天用甲醛、高锰酸钾进行熏蒸，一定要保证冷却室的洁净无菌。之后将灭菌后的栽培种培养基于干净无菌处冷凉，当温度降至25℃以下则可接种。接种要在无菌环境下迅速接完，量小可在接种房、接种箱；量大可于室外空气流通处搭建接种帐就地接种，接种帐消毒同前。

f.培养、检查：接种后的菌种放于25℃洁净环境中遮光培养，发现污染菌袋及时挑出。规模化生产时，可2天检查一次，一般待菌丝封住瓶口并向下生长1厘米后，则不易发生污染。随着菌丝的生长要注意不断加大通风量，并将菌种间距离、层数随时调整，密切关注培养温度，一定防止烧菌。

（2）栽培种接种

①接种前准备：待接原种、待接栽培种培养基、酒精棉球、火柴、油笔、气雾消毒剂、标签纸、接种勺、酒精灯、培养皿、镊子整齐有序地放入接种箱或接种帐工作台面。用苯酚或来苏尔进行空间喷雾，再以气雾消毒剂熏蒸40分钟后使用。

②消毒处理：依次用75%的酒精棉球将双手、接种台面、培养皿、接种工具，原种瓶外壁用0.1%高锰酸钾擦拭消毒。消过毒的工具放于培养皿上，不要再乱放。

③火焰处理：点燃酒精灯，用镊子将培养皿先进行灼烧，再将接种工具利用酒精灯火焰灼烧灭菌，灼烧时可拿接种工具蘸取95%酒精后火焰灭菌，之后放在培养皿上晾凉待用。

④无菌区接种：一般需2～3人接种。一人左手持原种，在酒精灯火焰无菌区，取下原种封口膜，用火焰封住瓶口，用接种勺将原种表层0.5厘米弃去，之后拿工具将原种轻轻挑成黄豆粒大小。在火焰无菌区，用接种勺迅速将原种颗粒接入待接栽培种培养基内，并使原种颗粒最好撒布满栽培种培养基料面。拿栽培种培养基的人要注意在酒精灯火焰无菌区打开袋口，手指不能接触袋口内璧，同时要用栽培种袋口迎接原种瓶口，不能反向。如此反复操作，1瓶750毫升原种以一端接种可扩接35～40袋栽培种培养基。接种结束后，及时清理干净接种台面。

⑤做好记录：接好种的栽培种培养基，按培养架逐架贴上标签，写明接种人、菌种名称、接种日期等。

⑥栽培种培养、检查：培养架也要提前消毒，再把接好种的栽培袋放在25℃左右的培养架上，不可摆放过于紧密，暗光培养。通常35～40天长满栽培袋。培养初期要及时检查，个体间长速差异明显、长速变缓、出现异常色素和杂菌菌落的菌种及时淘汰。

（3）栽培种鉴定、保藏

栽培种接种后第三天，即应开始进行检查。正常的栽培种应生长整齐，相同品种长速一致，色泽洁白，无绿色、灰绿色、暗褐色、橘红色、灰白色、黑灰色等杂菌菌落颜色，菌丝丰满、浓密、均匀，菇香味浓郁，无酸臭味和酒精味。具备以上特征的栽培种才是优良菌种。

长满的栽培种应及时使用。若不及时使用则应在5～10℃条件下保藏，在高温条件下，尽量缩短存放时间，否则栽培种会因袋璧脱水影响到菌丝活力。