第三节 植物病原物的室内检疫检验方法
一、植物病原真菌检疫检验方法与技术
真菌广泛分布于自然界中，由真菌引起的植物病害占植物病害总数的90％以上，其中可通过种子传播的约占3.5％。植物病原真菌除了少数是专性寄生菌之外，大多数都是兼性寄生菌，有的寄主范围较广，有的在种子上可存活半年以上，因此种传真菌很容易在异地引起为害，其中以鞭毛菌、担子菌和半知菌最为重要。例如水稻上的真菌病害有100多种，绝大部分可经种子传染。此外，绝大多数的植物病原真菌可以通过其寄主植物或产品的调运进行远距离传播。这些真菌可以潜伏在植物种苗的组织内，或附着在植物种苗、产品或其他材料的表面，其中有的呈休眠状态，有的继续营寄生生活并进行繁殖，到达新区后，遇适宜条件即定植下来造成病害的发生与流行。
我国2007年发布实施的《中华人民共和国进境植物检疫性有害生物》中，真菌有125种，2009年发布的《全国农业植物检疫性有害生物》中有6种。
在引起植物病害的病原微生物中，真菌的检验相对容易，对具有明显症状的植物材料可通过症状观察直接检验，而对症状不明显或难以识别时，则需选择其他方法进行检验。在植物检疫中常用的检验方法有：洗涤检验、分离培养检验、吸水纸培养检验和生长检验等方法，在这些检验方法中一般都要借助光学显微镜的观察，对病原作进一步鉴定，亦可借助于电子显微镜、荧光显微镜和血清学技术进行检验。
植物病原真菌的营养体多为菌丝体，大部分植物病原真菌还可产生无性和有性的繁殖体，这些菌丝体和繁殖体的形态特征是植物病原真菌鉴别的重要依据。有的植物病原真菌还存在致病性的分化，即可根据对不同寄主植物的适应性而分为不同的转化型，以及在同一转化型内根据对不同寄主植物品种的适应性而划分不同的生理小种。同一种病原菌内因致病性的强弱不同可分为强毒株系和弱毒株系。在植物病原物的检疫中有时涉及对不同株系或小种的鉴定，或近似种的区分，在这种情况下从形态特征上是很难作出判断的，而生物学鉴定往往需要很长的时间，因此需采用分子生物学的手段进行鉴定。
1.种子带菌的保湿培养检验
种子带菌是远距离传播植物病害的最有效途径。由于种子体积小、运输携带方便，国际及地区间种子的交流十分频繁，且往往数量巨大，并很容易通过试种或繁育向外扩散，因此种子带菌具有更大的风险性。在我国及国际植物检疫法规中，对种子及苗木的检疫要求都很严格，需进行审批或特许，且在引进后要加强监管。
一般种子携带的病原真菌，无论是黏附在种子表面的，或是潜伏在种子的内部，在适当的温湿度条件下或种子萌动后，即开始生长或侵染，在种子表面产生菌丝体或繁殖体，有的还可在幼苗的早期产生明显病害症状。因此对这类病菌，可通过对种子保湿培养进行种子带菌状况的检验。但对于种子带菌而萌发期或苗期不表现症状、也不长出病菌孢子的病菌，如麦类黑穗病菌等，这种方法不适宜。保湿萌芽检验除可了解种子的带菌率外，还可了解种子的发芽率和发芽势。有的真菌是通过种子内部带菌，检验时需将种子表面消毒，以杀死黏附种子表面的其他真菌孢子和细菌，然后进行萌芽，就可了解其内部带菌的百分率。这种检验方法，简单易做，不需要特殊的设备，操作也方便，所以应用很广。
保湿检验，因所针对的种子、病原真菌种类特性及目的和要求的差异，可采用不同的方法，且这些方法在实践的过程中在不断改进。
（1）吸水纸法检验（Standardize Blotter Method，SBM）吸水纸检验是离体与活体检验的结合，其操作方法如下：
①种子的摆放种子放在铺有湿润的吸水纸的培养皿中，通常为三层吸水纸以保持检验期间足够的湿度。如检验目标为浅色的真菌如轮枝菌（verticillium）则选用黑色或灰色的吸水纸以利于观察。种子根据其大小按一定的距离放置，植物残余组织和其他碎片也按适当距离分放在其他培养皿中，通常这些材料的培养时间较种子短。在水稻种子带菌的检验中，ISTA的标准检验方法是直径为9cm的培养皿，每皿放置25粒种子，每个样品测定400粒种子。
②保湿培养在一定的温度下培养一定的时间，通常为一周及（20±2）℃（多数种子发芽试验的标准温度）。不同的病原物可能需要不同的培养周期和条件，温度范围可以是寒带植物种子的12℃至温暖的亚热带和热带地区植物种子的28℃。培养箱应能提供近紫外线照射，这样可以促进许多种传真菌的孢子萌发，按标准紫外光照与黑暗周期为12/12h。
③观察用低倍的体视显微镜在50倍或60倍下观察真菌的生长。发现可疑种子后作好标记，统计带菌率，并记录观察到的真菌生长特性，如分生孢子梗的形状、长度及排列方式；分生孢子的形态、大小、分隔、颜色、链形成等及其在分生孢子梗上的排布；孢子团的存在、菌丝特征、菌落的密度等。根据这些特征和特性鉴定其真菌的种类。
为了避免种子萌发影响观察，可使用0.1％～0.2％的除草剂2，4-D代替纯水，抑制种子的萌发。但这种方法使用要求严格，因2，4-D也有一定的抑菌作用。对有些被腐生菌严重污染的种子，有必要进行预处理，常用1％～3％的次氯酸钠。
吸水纸检验法的最大优点是可以原位观察寄主上的真菌。已用于种子健康的常规检验，特别是在琼脂培养检验不适用的条件下，可采用该方法。吸水纸检验已用于各类种子，包括禾谷类、蔬菜、观赏植物和林业的种子的健康检验，具有离体调查和活体观察的优点。
（2）深冻吸水纸法检验（Deep FreezingBlotter Method，DFB）深冻吸水纸法是常规吸水纸检验的改进。按上述方法放好种子后，将培养皿置20℃放置24h，然后转移至-20℃深冻24h，再在（20±2）℃的条件下培养5d，条件同上。7d后在体视显微镜（60×～50×）下观察种子上真菌的存在及形态特点。此法可促进某些真菌的生长，而对腐生菌的生长有一定的抑制作用。
以上两种吸水纸检验适合于多种类型植物种子的种传真菌检验，已列为国际种子检验协会（ISTA）规定的种子健康检验常规方法之一。但有些重要的种传真菌采用此法并不能生长，同时有些生长迅速的腐生真菌常干扰试验结果。为克服这些缺点，许多研究者进行了改进，Elwakil等（2002）对常规的SBM和DFB进行了改进，用碱（KOH或NaOH）处理替代常规的水浸润滤纸，方法为：将三层吸水纸在0.2mol/ml KOH或0.3mol/ml NaOH碱溶液中浸润，然后放在培养皿中，每皿25粒种子，碱溶液要保证pH值达到14。培养皿在（20±2）℃条件下放置7d，并补充光照，光照与黑暗12h交替。
（3）琼脂平板法检验这种方法是将待检测种子放在琼脂培养基上，通过一定温度下的培养，使其在种子上产生菌落后进行鉴定。检验程序一般为：
①将种子依其大小按一定的距离放人盛有适当培养基的培养皿中，MEA或PDA是最常用的培养基。放置之前需对种子进行预处理以阻止腐生菌的产生，通常为在1％的次氯酸钠中浸泡5min，无需洗涤立即放在琼脂凝胶上。
②种子在一定的温度条件下（通常为20℃±2℃）培养5～8d，与吸水纸检验相同，植物残余组织及碎片也在相同条件下观察。
③记录真菌菌落特征，对某些种子中较熟悉的真菌菌落特征，可凭经验用肉眼观察板的双面，鉴定和统计菌落数。有大量的文献报道真菌在琼脂培养基上的培养特性，这些特性可作为鉴定的参考依据。
该方法存在的问题是同一种子产生多种菌落，即为真菌的混合感染，可能相互掩盖或抑制，在这种情况下可能有必要使用选择性培养基。
琼脂平板检验可用于那些受腐生菌影响较小的种子携带病原菌快速鉴定。尤其适合于当在吸水纸检验中不能提供病原菌菌丝生长、孢子发芽或症状产生所需条件，而在富营养的琼脂中能产生特异性菌落的种子真菌检验。这种方法在北爱尔兰广泛用于亚麻和栎种子的检验。
（4）保湿培养检验实例国际种子协会制定的种子健康检验标准中，有多种种传真菌性病原物的检验采用保湿培养检验。以玉米上2种病菌的检验为例，其检验标准如下：
①病原物玉米穗腐病菌（Cochliobolus carbonum）
方法：深冻吸水纸法（Deep Freezing Blotter Method）（McGee l994）
样品数：400粒种子
步骤：
a.随机取400粒种子，用水冲洗种子以除去种子处理后残留的化学物质；
b.将种子在0.5％（体积分数）次氯酸钠中处理3min，然后在含200mg／L苯菌灵和100mg／L硫酸链霉素（735单位／g）的灭菌水中处理30min；
c.在聚乙烯盒（25cm×15cm×4cm）中放两片无菌滤纸，用70ml，含0.035g氯硝胺杀菌剂（75％可湿性粉剂）的无菌水湿润滤纸；
d.将种子均匀放在滤纸上，置25℃培养2d后转移至-20℃至少15h；
e.转移至25℃培养7d，每天提供8h光照；
f.观察种子，取可疑的黑色至褐色菌丝在光学显微镜下进一步证实。
②病原物玉米粒腐镰刀菌（Fusariummonili forme）
方法：平面培养（McGee 1994）
样品数：400粒种子
步骤：
a.随机取400粒种子，设4个重复，每重复100粒，用水彻底冲洗种子以除去种子处理残留化学物质；
b.将种子在1.0％（体积分数）次氯酸钠中处理1min，然后用灭菌水洗3次；
c.将种子均匀置PDA（马铃薯葡萄糖培养基）上，通常每皿（直径9cm）放5～10粒种子；
d.置25℃培养7～21d，每天提供8h光照，定期检查菌落生长情况；
e.对可疑菌丝进一步检查是否有Fusarium monili forme的大分生孢子和小分生孢子。
2.种子带菌的萌芽法检验
将种子播种在灭菌的土壤、腐殖质、沙或其他类似的基质中，在标准的温度和湿度条件下，病菌侵染的种子和幼苗可产生与在自然的田间生长条件下相似的症状。以砂培养法、标准的土壤培养法和试管培养法为例，其操作方法如下。
（1）砂培养将灭菌的细粒砂湿润后作为基质，种子上覆盖一层2～3cm的粗粒砂，当种子较小时，粗粒砂仅1cm厚度即可。所用水量依所用容器而定。
这种方法相对耗时，一般需二周左右的时间。
（2）标准的土壤培养法培养基质为混合均匀的土壤，采用多营养钵的塑料盘，将土壤填入小钵后播种，上面覆盖一层塑料薄膜以保持适当的湿度，在适当的温度下培养。所需温度因寄主植物和目标病菌而定，一定时间后观察幼苗的症状表现，一般为2～4周，依种子的种类和温度而异。这种方法的测验条件与自然的田间条件相近，对幼苗的评价较在人工基质上更准确。但采用这种方法仅能观察到幼苗寄生病原菌引起的症状。
（3）试管培养法采用直径为16mm的试管，每管加入10ml水琼脂培养基。每管放人1粒种子，封好试管口以保持适当的湿度。然后放在20℃条件下培养，并提供12／12h的人工光照周期。待幼苗达到管顶时，将管盖取掉。培养所需时间依幼苗发育和症状表现而定，一般为10～15d。症状表现后调查发病情况，统计种子带菌率。
培养温度可因病原和寄主材料的不同有所变化，所用基质也可用营养液或选择性培养基代替，或在培养一定的时间后再提供营养。
采用这种方法，幼苗可以很好表现症状，能较容易观察幼苗的根部和绿色部分的症状，也可避免邻近植株间的相互感染。这种方法所用时间较短，但需准备培养基和大量清洁试管，操作起来较吸水纸检验相对繁琐一些。
萌芽检验也有局限性，如在对寄主生长发育不良，而适宜于病菌生长发育的条件下，则某些腐生菌可能变成萌芽阶段的寄生菌，造成幼芽发生部分病斑；另外萌芽检验主要还是依靠肉眼检查，由于多种病害可以产生类似的病症，就是同一种病害也可以发生不同的症状，这些情况都足以影响检验结果的准确性。要克服这些缺点，必须结合其他辅助办法进行检验。
3.种子带菌的洗涤法检验
洗涤检验在检疫中广泛用于检查附着在粮食和其他种子表面的各种真菌孢子。如禾谷类种子上的黑粉病菌、小麦矮腥黑穗病菌和甜菜种子表面的甜菜锈病菌的孢子等。其方法如下：
（1）抽取10～100g（依种子种类、大小而异）试样两份，分别放入三角瓶内，加入无菌水l0～100ml，振荡5～10min，使附着在种子表面的病菌孢子冲洗下来。有的种子表面因蜡质较多，不易湿润而影响洗涤效果，可在无菌水中加入0.1％的湿润剂（如0.1％肥皂溶液或吐温-20等）或其他去污剂，可以减少表面张力，使种子表面的病原物能充分洗涤下来。
（2）直接取悬浮液观察，或将悬浮液分别倒入洁净的离心管内，通过离心浓缩。一般采取在2000～4000r／min条件下离心10～30min，使病原菌孢子完全沉于底管，再用吸管将上部澄清液吸去，或直接倒出上清液，保留沉淀，然后每个离心管中加入少量的蒸馏水，振动离心管使沉淀充分悬浮，将各离心管中的悬浮液合并后，用量筒定容至一定的体积（体积大小以便于镜检观察为度）。立即取一滴悬浮液滴于载玻片上，用显微镜检查，鉴定病原种类，并计算每克种子上的孢子负荷量。
为保证检测的可靠性，一般对每一样品的洗涤液至少要镜检各5个玻片。计算单位质量种子的带菌量可采用以下方法：
①平均视野推算法吸取1滴悬浮液放在载玻片上，加盖玻片。每个玻片检查10个视野，5个玻片共50个视野，统计观察到的孢子数量，并求出每个视野的平均孢子数。用显微镜测微尺测定在一定的放大倍数下各视野的半径，算出每一视野的面积。根据盖玻片的面积，计算全玻片的视野数，再根据视野数、平均每视野上的孢子数、每毫升的悬浮液滴数计算出单位重量种子的带菌量。
每克种子的孢子量=（平均每视野孢子数×盖玻片的视野数×每毫升的悬浮液滴数×悬浮液定容的体积）／种子质量（g）
②利用纽鲍尔（NeLbauer）血球计数板测定孢子数血球计数板上刻有许多小方格，每一小方格的边长为0.05mm，面积为0.0025mm2，其深度为0.1mm，故每一小方格的体积为0.0025×0.1＝0.00025mm3，即1／4000000ml。
操作时，先将盖玻片盖在计数板的刻度处，然后用吸管吸取所需测定的悬浮液小心地从玻片的一侧将一滴悬浮液注入计数板刻度处与盖玻片间（注意液体不可溢出，并避免盖玻片下有气泡）。轻压玻片，然后将计数板置于显微镜下检查。通常共观察80个小格（或5大格），统计其中的孢子数量，求出平均每小格内的孢子含量，再乘以4000000，即为1ml悬浮液中的孢子数。由该孢子数乘以悬浮液体积，得出原有悬浮液的孢子总含量，除以检验种子的质量，即单位质量种子上的孢子负荷量。
采用以上方法计数时，也可根据单位质量种子的孢子数计算出每粒种子的平均带菌量。即每粒种子的平均带菌量=单位质量种子的孢子数／每克种子的种子粒数。
洗涤检验通过浓缩种子表面的孢子，并结合在显微镜下进行形态观察，是一种快速、简便有效的种子表面带菌的检验方法。但在进行定量分析时常因人为操作上的差异而引起一定的误差。如在洗涤的过程中种子或其他粮谷类产品表面所黏附的病菌孢子不一定能完全洗涤下来；有的真菌孢子常在悬浮液表面形成一层孢子薄膜，而管壁上也可能黏附着孢子，使检验结果很难代表实际情况，因而影响计算的准确性；孢子分布不均匀，所观察视野或计数板小格不同，其孢子量也有一定的差异，为降低这些差异，可设置一定的重复。
洗涤检验适合于孢子附着在种子表面容易洗涤下来，且这些孢子是重要的田间侵染来源的真菌。对有些真菌而言主要是通过孢子发芽后潜伏在种子中成为下一生长季节的重要侵染源，在这种情况下种子表面附着的孢子量不能反映可能的发病情况，有时需要采用或结合其他的检验方法（如保湿培养法等）。
4.带菌组织的保湿培养检验
有些植物病原真菌在条件不适宜时，在植物组织中生长缓慢，表面不易观察到真菌的菌丝体或繁殖体，而将带菌组织置于适宜的温湿度条件下，能很快长出菌丝或产生孢子和孢子梗等繁殖体，然后可借助显微镜观察进行鉴定。常用的方法是取植物的发病组织（叶片或茎段），自来水冲洗后用2％～3％的次氯酸钠处理1～2min，无菌水冲洗3～4次后，用灭菌的解剖刀切成小块或小的片段，放在铺有湿滤纸的培养皿内，在25℃左右的温度下保湿培养，以后镜检观察病菌的生长特性及营养体和子实体的形态。
5.带菌组织的分离培养检验
除一些专性寄生菌，如白粉菌类、某些锈菌和霜霉菌外，许多植物病原真菌都能在适当的培养条件下进行人工培养，因此可以通过分离培养法将它们从植物组织中分离出来，然后在人工培养基上获得纯培养物，作进一步的检验鉴定。在植物病原真菌的检验中分离培养是一种最常用的方法，主要应用于检验潜伏在种子、苗木或其他植物组织病斑及内部的病原菌。通过分离培养观察病菌的生长特性，并通过显微镜进行形态学方面的观察，可以较快地对某些病原真菌进行鉴定。
植物病原真菌分离培养的第一步是要配制培养基，培养真菌常用的是马铃薯蔗糖琼脂培养基（PSA）或马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA），但在分离有些较难培养的病原真菌时，必须用特殊的选择性培养基。分离培养所需用具可参阅植物病理学研究常用工具书。
分离培养成功与否的关键之一是材料的选择。一般选择新发病的器官或组织作为分离材料，在多数情况下可以取病部与健部交界处，以减少腐生菌的污染。在进行分离培养的过程中，一般需先进行组织的表面消毒，杀死植物组织表面的腐生菌，常用的消毒剂有0.1％氯化汞溶液、3％～5％的次氯酸钠水溶液和70％的乙醇。分离真菌的方法很多，常用的主要有组织分离法和稀释分离法。
（1）组织分离法是植物病原真菌分离最常采用的方法。从待分离材料上切取大小为4～5mm的小块病组织，经表面消毒和灭菌水洗涤后，放在琼脂平板培养基上，置适宜的温度下培养，待病原菌长出后再进行形态学鉴定或进一步纯化后接种鉴定。表面消毒时间的长短有时对分离能否成功的影响很大，时间不足容易出现腐生菌的污染，过长可杀死内部的病菌。因此应根据分离材料，所针对的病原真菌对象及所使用的消毒剂种类等的不同而异，不断摸索，积累经验。
（2）稀释分离法可用于某些产生大量孢子的病原真菌的分离。将发病部位的孢子挑取少量放入试管中的无菌水中，制成孢子悬浮液，并稀释配成不同浓度，与经冷却的熔化琼脂培养基混合后倒入培养皿中培养。待病原菌长出后再进行形态学鉴定或进一步纯化后接种鉴定。由于病菌孢子在植物的表面，且未经消毒处理，这种方法很容易出现污染，故应及时观察判断真正的病原菌，并及时纯化培养。
此外，各种真菌病害的发病部位和存在的植物组织不同，在分离时也要采取不同的方法。如分离潜伏于种子表层或深层的病菌，可先将种子表面消毒，用灭菌水洗涤后，将整粒或破碎后的种子置于培养基上。如果需要确定病菌的潜伏部位，可将种子表面消毒，经灭菌水洗涤后，放人消毒过的培养皿内，在无菌条件下用解剖刀分切成不同部分，移植于培养基上，或是先将种子分成不同部分再作表面消毒，然后进行培养。在分离块茎、块根及苗木、接穗等繁殖材料所带的病菌时，可先将病部用酒精或氯化汞液作表面消毒，洗涤后再挑取内部组织进行培养，或者切取与健全组织邻近的部分病部，进行表面消毒和洗涤，然后再培养。
在检疫检验中有时还涉及土壤带菌的检验，有的真菌菌丝体或其形成的菌核、休眠孢子等可以在土壤中存活很长时间，成为重要的侵染源。分离土壤中的病原真菌需根据病原菌的种类和繁殖体类型等采用不同的方法和不同的选择性培养基。如马铃薯癌肿病菌可以休眠孢子囊在病残体和土壤中越冬，可采用多种漂浮法，如氯仿漂浮法、二溴乙烷漂浮法和油漂浮法等进行分离。对土壤中的菌核可进行过筛方法分离，即采用不同孔径的筛子进行筛洗，然后用放大镜检查筛下物。这些分离到的菌核或休眠孢子经消毒处理后可在培养基上培养。
6.分离真菌的接种检验
在植物病原真菌的鉴定中，有时需要对分离的病原菌作进一步的致病性测定，即接种鉴定，以确定所获分离物是否为病原物。真菌的接种方法很多，在实际操作过程中可依据病原菌和寄主植物种类及病菌的传播和侵染途径等的不同而采用合适的接种方法。如种子传播的病原菌可用拌种法、浸种法、花器接种法；土壤传播的病菌可用土壤接种法、根部切伤接种法；气流雨水传播的病菌可用喷雾法、针刺法、剪叶法、涂抹法等。例如，在苜蓿黄萎病菌的检疫鉴定中采用浸根法，即从培养两周的病菌培养基上刮取分生孢子配成每毫升10个孢子的悬浮液，取在无菌条件下栽培4周长出3～4片真叶的高感苜蓿品种幼苗，清洗根部并用刀片切去主根根尖1～2cm，然后立即在孢子悬浮液中浸根5min，栽入营养钵中。在22～25℃和每天光照14～15h下培养，一周后进行症状检查。
二、植物病原细菌检疫检验方法与技术
引起植物病害的细菌称为植物病原细菌。已报道的植物病原细菌有300多种，引起多达千余种植物病害。这些细菌分属于薄壁菌门、厚壁菌门和软壁菌门。在自然条件下，细菌繁殖速度快，很易造成病害流行。
所有细菌性病害都可通过种苗传播，其中约40％可经由种子传播。植物病原细菌都是兼性寄生菌，可在种子等植物材料上存活较长时间，大多能在人工培养基上分离培养。在多年生寄主植物及无性繁殖材料中，细菌可在侵染组织、冠瘿（如土壤农杆菌）、块茎、根部和树皮的病斑中存活。在一年生寄主植物中，细菌更多依靠种子传播，种子在一年生作物细菌性病害的传播中起着重要的作用。细菌常附着在种子的表面，在这种情况下，细菌的存活期一般较短，为1～2年；而引起维管束病害或系统侵染的细菌可在种皮和其他组织中存在，其存活期较长，有的在适宜的条件下可存活20年以上。
细菌的分类和鉴定在很大程度上是基于其形态特征和生理生化特性，如细胞形态、鞭毛数量和着生方式、革兰染色反应、在特定培养基上的生长特性、色素的产生、生理生化反应等。此外，血清学方法也广泛用于植物病原细菌的鉴定，有的病原细菌还可采用PCR等技术进行鉴定。
1.细菌染色鉴定
不同分类单元的植物病原细菌各有不同的特点，如鞭毛数量和着生方式在不同属的病原细菌中是有一定差异的。细菌的鞭毛很细，在普通光学显微镜下不易观察，但通过鞭毛染色后则较容易在显微镜下观察，因此可用这种方法初步鉴定细菌种类。此外，革兰染色反应也是细菌鉴定的重要依据之一。如马铃薯环腐病菌革兰染色反应为阳性，再结合症状鉴定，便可确诊。又如甘薯瘟病菌，还可用Burdon染色法检验。重要植物病原细菌属的鞭毛染色和革兰染色反应特点如表7-2。
表7-2 重要植物病原细菌属的鞭毛染色和革兰染色反应特点
（1）鞭毛染色细菌的鞭毛很细，约0.02～0.03μm，在一般光学显微镜下观察不到。鞭毛染色主要是在媒染剂的作用下，使染色剂沉积在鞭毛上使之加粗。鞭毛染色的方法有多种，常用的有西萨基尔染色法（Ceseres-Gill）和银盐染色法。其操作步骤一般为涂片后，先用媒染剂处理数分钟，用水清洗晾干后，染液染色数分钟，水洗干燥后即可在显微镜下观察。
（2）革兰染色这是鉴定植物病原细菌属的重要依据，不同细菌胞壁的结构和化学特征不同，染色反应也不一样。常用的方法是用新培养菌涂片后，先用结晶紫染液染色，通过媒染剂碘液着色处理后，用酒精脱色，再经番红复染，在光学显微镜下观察呈红色的为革兰阴性，呈深紫色的为革兰阳性。
2.细菌的分离培养法及生理生化测定
在植物病原细菌的检验中常需进行分离培养，根据其培养特性作初步判断，有的还需进一步采用生理生化测定、致病性测定等方法鉴定。常用培养基包括普通营养培养基、鉴别性培养基或选择性培养基。细菌分离常用培养基有牛肉胨培养基（NA）和马铃薯葡萄糖（或蔗糖）培养基。鉴别培养基和选择性培养基有很多种，包括属和种的鉴别或选择性培养基。在鉴别性培养基上，目标细菌的菌落有明确的鉴别特征，选择性培养基则促进目标菌生长而抑制其他微生物生长。如：检测菜豆种子传带晕枯病菌（Pseudomonas syrzingaepvphaseolicola），可将提取液系列稀释后分别在金氏B培养基平板上涂布分离，在25℃条件下暗培养3d后，在紫外线或近紫外线照射下有蓝色荧光的菌落，为假单胞杆菌，可能是晕蔫病菌，再选择典型菌落作进一步的鉴定。
植物病原细菌的分离一般采用稀释分离法，通过稀释培养可以使植物组织中的各种细菌分离开，形成分散的菌落，根据菌落的形状、大小及颜色等可以初步鉴别病原细菌，并获得纯培养。在应用中可以采用培养皿稀释分离和平板画线分离。
（1）培养皿稀释分离将待分离的植物组织切成小块，经表面消毒和无菌水洗涤后，在无菌条件下置盛有少量无菌水的培养皿中研碎，使组织中的细菌释放到水中，然后用移植环取2～4环到另一盛有少量无菌水的培养皿中，混合均匀后，以同样的方法从第二个培养皿移到第三个培养皿中。然后在各培养皿中倒入冷却至45℃左右的培养基，凝固后翻转培养皿，在适宜的温度下培养观察。
（2）平板画线分离采取与上相同的方法制备组织浸液，然后用灭菌移植环蘸取浸液在琼脂平板上画线，一般先在平板的一侧划3～5条，再将培养皿转90o后，从第二条线的末端划出3～5条线（图7-1）。不同病原细菌要求的培养条件不同，如黄单胞菌要求的温度较高，因此可根据分离目标选择合适的培养条件。各种病原菌生长速度不同，出现菌落所需时间也不一样。一般而言，假单胞菌属和欧文菌属细菌生长较快，1～2d出现菌落，黄单胞菌属细菌生长较慢，需3～4d出现菌落，而棒状杆菌属出现菌落则需5～8d。根据菌落出现时间和特点可以初步判断分离结果。
（3）生化测定在获得细菌纯培养物后有时还需进行生化测定，包括测定其对碳源的利用与分解、对氮素化合物的利用和分解情况，以及通过产酸、产气、颜色变化等反应达到鉴别目的。如，检测甘蓝黑腐病病原细菌时，提取液在含牛肉浸膏蛋白胨淀粉的琼脂培养基上产生黄色菌落，当滴加鲁戈尔试液时，菌落周边培养基不被染色，则表示淀粉已被水解，该菌落可能为目标菌。
图7-1 平板画线分离
美国研制出一种专门用于细菌鉴定的专家系统即Biolog细菌自动化鉴定系统，该系统将细菌生理、生化过程的检测与先进的计算机管理手段有机地结合起来。应用时只需将经过纯化后的病原细菌制成菌悬液，再接种到Biolog反应板上，在4～24h后便可得到准确的鉴定结果。该系统的使用，在很大程度上简化了传统的细菌鉴定程序。
3.分离细菌的接种检验
为确定分离到的细菌为病原细菌或对植物材料进行检验以了解是否带有某病原细菌，常需要进行致病性测定。即将分离到的细菌接种到特定的寄主植物上，在一定的控制条件下观察植物的反应。一般用在固体培养基上培养的新鲜细菌加灭菌水配置成一定浓度的悬浮液（107～1008CF①／ml），采用适当的方法接种寄主植物。寄主植物的选择是决定接种成功与否的重要因素，在感病植物的感病阶段接种较易成功，接种后要在较高的湿度下保持一定的时间。
接种的方法有很多，包括针刺接种、喷雾接种、剪叶接种、注射接种、伤口接种、组织薄片接种和根部接种等，在实际操作中应根据病原菌的传播方式和侵入途径选择合适的接种方法。其中针刺接种是常用的方法，即用针或针束沾菌液后穿刺植物的叶片、茎秆或果实等，细菌经穿刺伤口侵入寄主，如针对水稻细菌性条斑病菌，在水稻苗期至抽穗期采用此法在叶片尖端1／3处穿刺接种成功率可达100％。剪叶法常用于既可从自然孔口侵入也能从伤口侵入并在维管束蔓延的细菌的接种，不需保湿，操作简便。而喷雾接种主要用于从自然孔口侵入的细菌。组织薄片接种主要用于引起腐烂病（包括软腐病）的细菌，通过针刺点或伤口接种组织薄片。此外植物的果实也可作为接种材料。
4.分离细菌的过敏性反应（HR）测定
有的植物病原细菌，如假单胞菌属细菌和解淀粉欧文菌及部分黄单胞菌可诱导烟草等寄主植物产生过敏性反应。因此，当分离到大量的细菌菌株时，为尽快鉴定出病原菌可采用烟草过敏反应进行快速筛选。常用的方法是用注射针将一定浓度的细菌悬浮液从烟草叶片的下表皮注入叶肉细胞间，在25℃左右的温度和正常日照条件下24～48h即可表现出枯斑反应。用烟草作为测定寄主时，只有该植物的非致病细菌能产生过敏性反应，而其致病性细菌有时产生典型的病害症状。黄单胞菌可用番茄或辣椒作为过敏反应测定植物。
5.植物病原细菌的噬菌体检验
（1）基本原理噬菌体是感染细菌和放线菌的病毒，其中能侵染细菌的噬菌病原细菌注射接种体称之为细菌噬菌体。它在自然界分布很广，凡是有大量细菌的场所，几乎都有它们的噬菌体存在，且噬菌体的数量消长常与该寄主细菌数量消长成正相关。噬菌体感染细菌后，能在活细菌细胞中寄生繁殖，破坏和裂解寄主细胞。当进行细菌液体培养时，噬菌体能使混浊的细菌悬浮液变得澄清；固体平板培养细菌时，如混有相关的噬菌体，则会出现许多边缘整齐、透明光亮的圆形无菌空斑，称为“噬菌斑”，肉眼即可分辨。
噬菌体的寄主范围常有一定的专化性。有的噬菌体专化性很强，只能侵染某一种细菌的个别菌株，即单价噬菌体；有的噬菌体则寄主范围较宽，能侵染同一个属的不同种或同一种菌的多个菌系，即多价噬菌体。
根据噬菌体与寄主细菌的消长关系和寄主专化性特点，可以利用噬菌体来追踪病原细菌潜伏的场所，测定细菌的种类和数量，探索病菌的消长规律，进行病害的预测预报以及应用于植物病原细菌的检疫检验。另外，可以利用专化性噬菌体鉴定病原细菌的菌系，也可利用多价噬菌体了解各种细菌在进化上的亲缘关系。
在植物组织或种子的表面常有很多的细菌，进行病原菌的分离检验有时较困难。而应用噬菌体检验法检验时，不需要分离细菌和作进一步鉴定，可以快速获得检验结果。
（2）噬菌体检验方法在细菌的噬菌体检验中，常采用的方法有两种：①利用指示菌细菌来检测样品中是否存在相关的噬菌体，以此来判断样品中是否有该噬菌体的寄主细菌存在；②利用已知噬菌体来检测样品是否有相应的寄主细菌存在，即在待检样品的浸泡液中加入一定浓度的某种已知的噬菌体，培养一定的时间后，再测定噬菌体的数量，如果噬菌体数量明显增多了，即表明该浸泡液中有已知的噬菌体的寄主细菌存在。
应用噬菌体检验种子是否带有病原细菌，是一种快速、简单易行的方法。其最初是用于菜豆种子携带细菌性疫病菌（Xanthomonas axono podis pv phaseoli）和晕枯病菌（Pseudomonas syringae pv phaseolicola）的检验（Paul Neergaard，1983）。操作方法如下：
①取菜豆种子250g，用2％的次氯酸钠浸泡10min进行表面消毒；
②放入捣碎机中，加入灭菌营养液捣碎5～7min；
③该样品培养24h，使细菌繁殖；
④取10ml培养液至一灭菌的三角瓶中，并加入含有4000～5000个噬菌体粒子的悬浮液；
⑤立即取0.1ml的该混合液，加入到有指示菌的平板培养基上；
⑥6～12h后记录噬菌斑的数量。当有同源菌存在时，噬菌斑的数量明显增加。
噬菌体检验现已应用于多种植物的病原细菌检验，我国已将该法列入“水稻种子产地检疫规程”，用于检验稻种中的白叶枯病菌。近年我国有关单位也用于水稻细菌性条斑病和玉米细菌性枯萎病菌的检验。在进行水稻种子检验时，由于白叶枯病菌、细菌性条斑病菌和噬菌体主要存在于颖壳内外，而米粒上极少，因此一般只需测定颖壳即可。检测稻种携带白叶枯病菌、细菌性条斑病菌的方法与步骤如下:
①样品经充分混匀后随机称取10g，将种子脱壳、磨碎，放入灭菌的烧杯或三角瓶中，加入20ml无菌水，浸泡30min后用纱布过滤。
②取滤液1ml放人灭菌的培养皿中，加入新鲜培养配置的指示菌1ml（浓度4×1010CFU／ml），混合均匀。
③放置10min后，加入熔化后冷却至45℃左右的牛肉汁蛋白胨琼脂培养基，迅速混匀，冷凝后置25～28℃恒温箱中，进行平板培养。
④12h后检查平板上有无噬菌斑，有噬菌斑出现则表明该稻种中存在目标细菌，且可根据噬菌斑的数量初步判断种子带菌量。
在采用该方法时，如目标菌存在一定的分化，配置指示菌液就需要将不同菌株进行混合，以确保能检测出具有不同寄主专化性的噬菌体。
在细菌的噬菌体检验中，其效果与噬菌体的寄主范围有很大的关系，专化性太强会限制噬菌体的应用范围和效果。在实际应用中，特别是在利用已知噬菌体的消长测定目标细菌时，应了解噬菌体的寄主范围，根据检验目的选择具有种或菌系专化性的噬菌体菌株。同样，利用指示菌检测噬菌体也需要获得能被该菌不同噬菌体株系侵染的细菌菌系，才能获得准确的结果。在日本，噬菌体已成功应用于柑橘溃疡病病菌检验，其主要原因是分离获得了Cpl和Cp2两个株系的柑橘溃疡病菌的噬菌体，这两个株系具有较好的广谱性，对来自日本不同柑橘产区的柑橘溃疡病菌的检出率达98％以上。
6.种子潜带病原细菌的生长检验
这是将待测种子播种在一定的基质材料上，在适宜的温度下，促进种子的发芽和实生苗的生长，然后根据幼芽和幼苗上出现的症状作出初步诊断的检测方法。必要时还需结合其他方法进一步诊断鉴定。
（1）水琼脂培养基平板法如检验甘蓝种子传带黑腐病菌（Xan thomonas campestris pv.campestris）的Srinivasan方法。用抗生素（如200×10-6的金霉素）浸种3～4h后，沥干浸泡液后将种子置于1.5％的琼脂平板上，每个培养皿放置25粒种子，在20℃下暗培养8d，用放大镜观察幼芽和幼苗的症状。带菌种子萌发后，幼苗下胚轴及子叶黄化和腐烂，幼苗倒伏在琼脂上，侵染部位可见淡黄色菌浓，有的子叶边缘形成“V”型黑褐色病斑。也可将细菌转接到黄单胞菌选择性培养基上进一步确认。
（2）卷纸法（roll towel method）Singh等（1977）建立了用于水稻种子细菌性叶枯病菌检验的卷纸法，其步骤如下。
①取400粒种子，均匀放在两片纸巾中（45cm×28cm，先用水浸湿），8个重复，每个重复50粒种子。
②将纸卷起，并用皮筋封闭两端，以向上的方向置（30±2）℃条件下培养5～9d，每天日光照射12h。
③移去皮筋、打开卷筒，仔细检测实生苗症状，取少数可见水渍状、褐色或黄色失绿症状的叶鞘、幼叶在显微镜下观察菌浓。如观察到菌浓再进一步分离和测定致病性。
④取表现侵染症状的幼苗，剪成小片，放入盛有蒸馏水的烧杯中放15min，含有细菌的水可直接用于致病性测定或采用常规的方法进行分离获得纯培养后测定致病性。48～72h后观察植株症状表现。
⑤致病性测定可采用三种方法：a.将剪刀浸入细菌悬浮液，然后剪叶接种（30～40片叶）；b.将剪刀和叶片同时放在细菌悬浮液中剪叶；c.用细菌悬浮液喷雾接种有剪口的叶片。
⑥接种后48～72h观察症状，自接种端产生水渍状条斑，数天后病斑扩大成为黄色。
在种子带有病原细菌的生长检验中还可采用其他多种保湿的方法，如在培养皿中铺上3层滤纸，罩上玻璃罩（其高度保证幼苗有足够的生长空间），然后置一定温度和有适当光照的条件下萌发生长，然后观察症状。也可用多隔的盒代替培养皿，在各隔中放上尿素湿透的保湿纸，然后将种子摆放其中，待长出幼苗后观察症状。
生长检验法的优点是直观、简便，但需占用较大空间，较费时，不适合检测大量种子。有时存在真菌污染，出现症状混淆，难以鉴定。带有细菌的种子还可能丧失萌发能力，不能进行症状观察。在检疫中生长检验多作为初步检验或预备检验。
7.血清学检验
植物病原细菌的鞭毛和整个菌体都可作为抗原，用于细菌抗体制备的抗原可以是非纯化的抗原，如活的细菌液或经热处理或超声波破碎的菌体；也可以是纯化的抗原，包括多种方法浸提的核糖体、糖蛋白和膜蛋白等。有的蛋白（如糖蛋白和膜蛋白）在某些病菌中表现为种或亚种的特异性，用该抗原制备的抗体可以用于细菌的亚种或分类鉴定。活细胞抗原中鞭毛蛋白和胞外多糖等在不同细菌中有时存在交叉反应，影响检测结果的特异性，可通过将细菌在60℃下处理1.5h或100℃处理1h，破坏鞭毛蛋白等以提高其特异性。
目前已用于细菌检验的血清学方法很多，包括多种免疫沉淀反应及在固相支持物上进行各种酶联免疫吸附分析（ELISA），这些方法与植物病毒检验相似。需要注意的是在细菌的检验中常因大量的其他微生物存在以及不同细菌间交叉反应的存在而影响其特异性，选择特异性好的抗体是获得准确检验结果的关键。
目前已有一些公司可提供用于细菌快速检验或原位分析的单克隆和多克隆抗体试剂盒，利用这些试剂盒可进行玻片凝聚试验、免疫荧光分析和ELISA检验。
（1）免疫荧光技术（immuno fluorescence techniqIles，IF）是将抗体IgG与荧光素进行结合形成一种带有荧光标记的抗体，这种抗体可以是病原特异的抗体，也可以是一种间接的通用标记抗体。当有相关的抗原与抗体发生反应时，可以形成抗原-抗体-荧光素复合物，借助荧光显微镜的光激发，可看到荧光素发出的特殊荧光；当不存在相关抗原与抗体的反应时，看不到荧光，因此可以用这种方法鉴别抗原和检测病菌。这种方法尤其适合细菌的检验，细菌相对病毒而言要大得多，在荧光显微镜下可以直接观察到菌体形态及其表面抗原是否与抗体反应，发生特异反应的细菌菌体外可见明显的荧光。
用于标记的荧光染料种类很多，其中常用的有异硫氰酸荧光素（FITC）、罗达明和得克萨斯红（Texas Red），这几种荧光染料的特性如表7-3。
表7-3 常用荧光染料的特性
免疫荧光技术通常采用间接法，其操作步骤如下：
①制片将细菌悬浮液均匀涂布在洁净的载玻片上，空气中干燥15～20min，必要时使用固定剂进行固定。
②一抗结合加入用3％牛血清白蛋白（BSA）磷酸缓冲盐（PBS）适当稀释而未经标记的细菌特异抗体溶液覆盖玻片上的样品，室温下在保湿的容器中培养0.5～2h，然后用PBS洗涤3次。
③加入荧光素标记的二抗方法同上述“一抗结合”，但孵育时间为20min～1h，洗涤后在荧光显微镜下观察。
在具体操作时，应通过预备试验确定抗体的适宜工作浓度，既要能产生有效的信号，又要避免增强非特异性染色。荧光观察时常见的问题就是荧光淬灭，各种荧光染料激发和发射荧光的能力有限，经过一定的时间后荧光会逐渐消失，因此要尽快作出评价和照相。
（2）血清学检测技术的改进在植物病原细菌的检验中采用单克隆抗体检验虽可提高检测的特异性，但还存在灵敏度低的问题（最大105～106CFU／ml）。已有研究发现，在ELISA分析前进行富集培养可显著提高灵敏度，这种方法（即Enrichment-ELISA）对潜伏侵染的检疫性细菌检验有重要的意义。采用这种方法进行检测前需要针对不同的植物病原细菌进行相关试验，因为富集培养的培养基、培养温度、时间等和培养条件均是影响该检测技术效果的重要因子。P.solanacearrum是引起马铃薯萎蔫病的重要病原，在欧共体及许多其他国家已将其列为重要的检疫性病原物。该细菌随种薯的调运而传播，在种薯上有时呈潜伏侵染而检验较困难，CarLlso等（2002）采用预先的富集培养与单克隆抗体（MAb8B IVIA）间接ELISA相结合的方法（E-DASI-ELISA），可使其检测灵敏度达1～10CFU／ml。
8.已建立的细菌检验标准及操作方法实例
目前各国已建立了多种植物病原细菌检验的标准，以下为种子潜带大豆细菌性枯斑病菌的检验操作技术标准。
大豆细菌性枯斑病菌（Pseudomonas syringaepv.Glycinea）生物化学鉴定和血清学及致病性测定标准。
方法1：混合种子浸泡-生物化学测定（soaked bulk seed-biochemical confirmation，Chauveau，1988）
样品：5000粒种子
（1）操作步骤
①5份大豆种子，每份1000粒，在4～5℃条件下经600ml灭菌水处理，并在用磷酸缓冲液将pH值调至6.5的自来水中浸泡24h；
②浸泡液按3倍稀释，取每样0.1ml加入添加有10g／ml先锋霉素的金氏培养基B（King’S，KBC）中；
③25℃培养2～3d后，在紫外线（370nm）下挑选产生蓝色荧光的P.s.Glycinea的可疑菌落，每份种子取5个菌落，在King’s B培养基上再培养；
④将这些再培养物通过果聚糖产生反应和氧化酶及七叶苷水解测验进一步证实P.s.Glycinea。
（2）培养基配制
①King’s B培养基：
蒸馏水 1L 甘油 15ml
蛋白胨 320g MgSO4·7H2O 6g
K2HPO 42.5g 琼脂 20g
灭菌后加入4ml先锋霉素（cephalexin）储存液（1g／100ml水）
②七叶苷水解琼脂培养基（Esculin Hydrolysis Agar）：
蒸馏水 1L NaCl 5g
NH4H2PO4 0.5g 酵母提取物 5g
K2HPO4 0.5g 柠檬酸铁铵 0.5g
MgSO4·7H2O 0.2g 七叶苷 1g
方法2：混合种子捣碎-血清学及致病性测定（ground bulk seed-serological and pathogenicity confirmation，Alvarez等，1995）
样品：5000粒种子
（1）分离步骤
①取大豆种子5份，每份1000粒捣碎，然后加入600ml灭菌的钠盐溶液（0.85％NaCl），在摇床中25℃、220r／min条件下振荡2h。
②浸泡液按3倍稀释，每样取0.1ml，加入到添加有10g／ml先锋霉素的金氏培养基B中。
③25℃培养2～3d后，在紫外线（370nm）下挑选产生蓝色荧光的P.s.Glycinea的可疑菌落在KBC上进行再分离。
④各组样品的P.s.Glycinea可疑菌落采用致病性测定和玻片凝聚试验证实。
（2）致病性测定
①通过接种温室生长15d的大豆幼苗（品种Oakland，Beeson，Acme和Flambeau）进行，接种方法为用灭菌棉花蘸取病菌悬浮液（约100CFU／ml）在叶面摩擦。
②接种后的幼苗置有光照、25℃和相对湿度90％的培养箱中放置48h，然后转移到温室中，接种4～7d后观察叶片上的坏死斑。
（3）凝聚试验
①每个菌落取10ml悬浮液在聚乙烯微量ELISA板中与10L（1：1000稀释）抗体混合。
②将板置于25℃和速度为220r／min下振动1h，然后在体视显微镜下观察凝聚反应。
三、植物病原病毒及类病毒的检疫检验方法与技术
病毒（virus）是一类个体极其微小的专性寄生生物，其结构简单，为非细胞形态的生物体，主要由内部的核酸和外部的外壳蛋白（CP）所组成。每种病毒只有一种核酸，即RNA或DNA，外壳蛋白亚基按一定的方式排列在核酸外，二者构成病毒粒子。植物病毒相对动物病毒和细菌病毒其形态结构更为简单，粒体更小。在合适的条件下，病毒的核酸能以很快的速度在寄主体内进行复制，每个植物细胞内可以产生数百万到上千万个病毒粒体。
引起植物病害的病毒称为植物病原病毒，其种类很多，是仅次于真菌的重要病原类群。近年来，随着病毒研究技术的提高，人们对病毒基本性质的认识不断提高，有关病毒分类的研究也不断深入，新的病毒种类不断增加。2000年9月，国际病毒分类委员会（ICTV）最新公布的病毒分类第7个报告中，植物病毒增加到15个科、72个属、909种，其中664种归类到15科的不同属，245种由于分类信息有限，只归到24个属，无科的分类单元。
（一）植物病毒传播途径
在自然条件下植物病毒可通过不同的途径传播，导致植物病毒病害的扩展蔓延。归纳起来植物病毒的传播途径主要包括以下几种：
1.机械传播（mechanical tralasmission）
即通过田间的接触或室内的摩擦接种传播。有些病毒很容易机械传播，如线虫传多面体病毒属（Nepoujrus）病毒常可经果树修剪传播，这类病毒的一个重要特点是在寄主植物中的浓度高、稳定性强、病毒能进入表皮细胞。引起不同症状表现的病毒传播特性也有一定的差异，如引起花叶型症状的病毒，蚜虫和线虫传染较机械传染更容易，而黄化型症状和韧皮部局限病毒难以或不能机械传染。
2.无性繁殖材料传播
病毒在植物上一般为系统性侵染，除生长点外的其他各部位均可带病毒。因此所有的植物病毒都可随种苗、种薯或其他无性繁殖材料传播，这种传播方式在以球茎、块根、接穗进行繁殖的作物中尤为重要，如马铃薯、花卉、大蒜、果树等。
3.种子传播
有的病毒可通过种子传播给下一代，据估计约有五分之一的病毒可以种传，如马铃薯Y病毒属（Potyuirus）、线虫传多面体病毒属（Nepoujrus）和等轴不稳环斑病毒属（Ilaruuirus）等的多种病毒可经种传。在寄主植物中，以豆科、葫芦科、菊科和核果类果树等植物病毒种传较常见。种子带毒比例差别很大，有的可达100％，有的不足1％，这与病毒和寄主植物种类有密切的关系。同种病毒在不同的寄主植物上的种传率有较大的差异，如树莓环斑病毒（Raspberry ringspot uirus）在Capsella bursa-pastoris上的种传率为2％～3％，而在甜菜（Beta vulgaris）上的种传率达50％以上。有的病毒在同一寄主植物上因其株系不同种传率也不同。
4.介体传播
在传病毒的介体中，大多数为昆虫介体，其中70％以上为同翅目的蚜虫、叶蝉和飞虱。有的病毒可通过线虫、真菌和寄生性种子植物传播，少数可通过螨类传播。有的介体（如线虫和真菌）存在于土壤中，因此土壤的移动也可引起病毒的扩散。
同一植物病毒可能有多种传播方式，也有的病毒传播方式较单一。在各种传播方式中，病毒随种薯、种苗和其他无性繁殖材料（如鳞球、茎、接穗等）以及种子传代是其重要的远距离传播途径。在对外引种的过程中很容易使病毒随这些繁殖材料传到新区，这些材料是病毒检疫检验的重点。近年来，我国对外引种频繁，病毒传入的概率也随之增多，仅2002年全国截获的植物病毒就有8次，涉及6种病毒。
多数植物病毒在调运材料上不产生明显可见的症状，从外观上难以判断，在检疫检验中必须采取特定的检测方法。病毒检测对技术的要求高，否则在检疫过程中很容易导致漏检，因此，通过引种传入的病毒可能远远超过截获的数目。此外，由于目前尚无有效的防治植物病毒病的制剂，在许多植物病毒的控制和检疫中，培育和生产无病毒的种苗是重要的措施之一，为确保这些繁殖材料无病毒也需进行严格的检疫检验。在病毒的检疫中有时还涉及对一种病毒的特定株系进行检验，如在美国针对马铃薯Y病毒（PVY）的检验，仅将该病毒的坏死株系（PVYN）列入了检疫名单，该株系在烟草、番茄和辣椒等作物上引起严重的病害，因此美国要求从加拿大输入的马铃薯种薯必须不带有该病毒株系，而允许带有少量非坏死株系的PVY。
（二）植物病毒鉴定方法
为适应检疫的需要，世界各国十分重视病毒检测技术的研究，在病毒快速灵敏的检测技术建立和完善、检测试剂的研制以及相关检疫检验标准制定等方面做了大量的工作。总的来说，目前在病毒检测中采用的方法是多种多样的，主要是依据病毒的形态特征、生物学特性及其分子组成而研制的，包括电镜观察、利用鉴别寄主进行生物学鉴定以及血清学检测等方法。近年来，分子生物学技术在植物病毒研究中得到广泛应用，开发出多种灵敏快速的PCR扩增和核酸杂交技术用于病毒检测，极大地提高了病毒检测效率。
1.生物学鉴定
各种植物病毒都有一定的寄主范围，病毒侵染寄主植物后有的表现明显可见的外部症状，而在有的寄主植物上病毒可进行正常的增殖，但不表现明显的症状，即表现为潜伏侵染。除自然寄主外，有的病毒还可通过人工接种的方式传到其他寄主植物上并产生特定的症状，这些症状可作为该病毒的鉴别特征，这种能鉴别某种病毒的植物通常称为指示植物或鉴别寄主。有些鉴别寄主在某种病毒侵染后易产生枯斑，因此也将产生枯斑的寄主称为该病毒的枯斑寄主。
鉴别寄主包括草本植物和木本植物。在生物学鉴定时，需将病毒接种到这些鉴别寄主植物，然后观察症状表现。常用的人工接种方法包括汁液摩擦接种和嫁接传染，有的病毒不能通过机械接种传染，而需借助介体昆虫（如蚜虫、飞虱等）或寄生植物菟丝子等进行传染。
（1）草本指示植物鉴定可用作病毒鉴定的草本指示植物种类很多，其中较常用的多为藜科、茄科、豆科、葫芦科等科的植物。
在进行草本指示植物鉴定时，一般采用汁液摩擦接种法。从待检的植株上取一定的组织，可以是叶片、花瓣、根或表皮，加入2～5倍的提取缓冲液，在低温条件下研磨，然后蘸取汁液在撒有金刚砂的供试指示植物叶片上轻轻摩擦，接种完毕后立即用蒸馏水冲洗叶片上残留的汁液。接种后的指示植物一般放在22～28℃、半遮阴的条件下生长，定期观察并记录指示植物的症状反应。
常用的接种样品提取缓冲液为0.02mol／L、pH值为7.2～7.8的磷酸缓冲液（PB）或pH值为8.2左右的Tris-HCl缓冲液。当待检测样品为木本植物时，在提取缓冲液中加入一定浓度的抗氧化剂，以降低寄主植物中多酚及丹宁类物质的氧化产物对病毒的钝化作用，可以提高接种成功率。如苹果、梨和葡萄病毒接种提取缓冲液常为含0.02mol／L巯基乙醇和2.5％烟碱的0.02mol／L、pH值为7.2～7.8的磷酸缓冲液。一般情况下，将草本指示植物在遮阴条件下放置24h后再接种，可以提高接种成功率。
有时不同病毒存在寄主交叉现象，即不同病毒具有相同的草本寄主，并且在其中某些草本植物上症状相似，在这种情况下可选用多种草本指示植物同时进行鉴定。南芥菜花叶病毒（Arabis mosaic virus，AMV）、烟草环斑病毒（tobacco ring spot virus，TRSV）和番茄环斑病毒（Tomatoring spot virus，TRSV）为我国颁布的禁止进境的病毒，均为线虫传多面体病毒属（Nepovirus）病毒，病毒粒子形态相似，且都可侵染葡萄，但其草本鉴别寄主谱和症状表现有一定的差异（表7-4）。
如前所述，并非所有的植物病毒都可通过汁液摩擦接种传染至草本植物，如柑橘速衰病毒，截至目前尚未发现其草本寄主。大多数草本指示植物对多种病毒都很敏感，且自然条件下大多数植物（包括杂草）都感染有1至多种病毒，有些病毒很易通过介体昆虫（如蚜虫等）传染，因此，草本指示植物应在严格的防虫条件下隔离繁殖，以免交叉感染，影响结果的判断。
表7-4 TRSV，AMV和TRSV在草本鉴别寄主上的症状特征
①以上所列为3种病毒的部分草本鉴别寄主。
此外，有些草本植物病毒可采用嫁接法进行接种鉴定，如草莓病毒鉴定常采用小叶嫁接接种法，即采取待检植株的小叶，将叶柄基部削成楔形后，嫁接至指示植物的中间小叶处。这种方法也适合瓜类病毒的嫁接鉴定，具体步骤如图（7-2）。
（2）木本指示植物鉴定所有的果树及林木的植物病毒都可通过嫁接的途径传染，因此，可将待检的果树、林木材料的接穗嫁接到对该病毒敏感的木本指示植物上进行鉴定。木本指示植物鉴定常用的嫁接接种方法有芽接法和切接法。
①双重芽接法双重芽接法鉴定即是在砧木的基部嫁接1～2个待检样本的芽片，然后在其上方嫁接一指示植物芽片，两芽相距1～2cm（图7-3）。嫁接一般在8月中下旬进行，翌年春季苗木发芽前，在指示植物接芽的上方约1cm处剪除砧干，苗木发芽后摘除待检芽的生长点，促进指示植物生长。由于多数果树及林木病毒不能通过种子传毒，因此可以用其实生苗作为嫁接基砧。
图7-2 草莓病毒指示植物小叶嫁接鉴定1透气孔；2保湿塑料袋
②双重切接法此法多在春季进行，在休眠期剪取指示植物及待检树的接穗，砧木萌动后将带有2个芽待检树接穗切接在砧木上，然后将指示植物接穗嫁接在待检接穗上部。为促进伤口愈合提高成活率，可在嫁接后套上塑料袋保温保湿。此种方法的缺点是嫁接技术要求高，成活率低，嫁接速度慢（图7-4）。
③指示植物直接嫁接法先培育指示植物，然后在指示植物基部嫁接待检植株的芽片，接芽成活后剪除指示植物的苗木，留2～3个饱满芽，使其重新发出旺盛的枝叶，然后观察指示植物的症状表现。指示植物的繁育可通过在实生砧木上嫁接，也可扦插（如葡萄病毒指示植物）或直接播种（如核果病毒指示植物）。本法的缺点是要求繁育数量较多的指示植物，所需时间长。
生物学鉴定是病毒鉴定的传统方法，由于其观察结果的直观性、鉴定结果的可靠性能准确地反映病毒的生物学特性，目前仍有广泛应用。
2.血清学检测
血清学方法由于具有快速、灵敏、操作简便和同时可进行大量样品检测等优点，在植物病毒的检测中得到广泛的应用，是检测植物病毒最为常用和有效的手段之一。应用血清学方法检测植物病毒，主要是通过病毒表面抗原与其对应的抗体发生特异性结合，形成抗原-抗体复合物，然后观察复合物沉淀现象或对结合抗体的进一步检验而实现对病毒的鉴定。因此，采用该项技术的前提条件是要获得待检病毒的特异抗体。
图7-3 病毒双重芽接鉴定
图7-4 病毒双重切接鉴定
病毒为核蛋白，是良好的抗原，其抗原性由外壳蛋白的氨基酸组成二级结构所决定。将病毒注射到动物机体后，可刺激动物的免疫系统应答，产生特异性抗体。这些抗体在发生免疫反应的动物血清中大量存在，这种含有抗体的血清称为抗血清（antiserum）。在抗血清中可有多种免疫球蛋白，包括IgG、IgA、IgM、IgD和IgE五种，其中IgG和IgM是主要的免疫球蛋白，具有抗体活性的主要是IgG。
抗体与抗原的结合是特异性的，一种抗体分子只能与其对应的抗原结合。在抗体上存在与抗原物质抗原决定簇互补的抗原结合位点。每个抗原分子的表面有多个抗原决定簇，因此可与多个抗体分子结合。不同的抗体具有不同的抗原结合价，其中IgG为单体分子，为Y形结构，每个IgG分子具有3个多肽区，其中2个多肽区组成Y形臂的抗原结合位点（也叫做抗体活力点），即为双价分子，另一个构成Y形的基部。用胃蛋白酶分解IgG可以得到一个Fc片断和（Fab）2片断，后者具有抗体活性，可与2分子抗原相结合。用木瓜蛋白酶降解时，得到一个Fc片断（具免疫调节功能）和2个Fab片断（与抗原结合的片断）（图7-5）。
（1）植物病毒抗体制备
①病毒抗原的分离纯化制备较纯的抗原是获得理想的血清学检测效果的重要前提条件，为避免在血清学检测中可能出现的非特异性反应，一般要求获得高纯度的病毒提纯物。植物病毒的提纯就是采用物理的和化学的方法，将病毒与寄主植物的各种组分分离，以获得较纯的病毒提取物。在进行病毒提纯时，常因病毒种类和寄主植物的不同而采取的制备方案亦不相同。由于同一寄主植物可感染多种不同的病毒，有些病毒在形态和大小上相似，采用物理和化学方法不易分开，在提纯病毒前应先进行病毒的分离和纯化。一般选用枯斑寄主、选择性寄主或特异性接种介体，通过单斑分离、寄主或介体对病毒的选择达到分离目的。如马铃薯X病毒和马铃薯Y病毒可通过介体分离，前者不能通过蚜虫传染，后者可经蚜虫传染。
图7-5 IgG分子结构示意
同种病毒在不同的寄主植物体内含量有所不同，选择合适的繁殖寄主对获得大量纯化抗原是必需的。对于一年生草本寄主植物来说，病毒的含量相对较高，很适合作繁殖寄主，此外，自然寄主也可作为繁殖寄主。而在多年生的木本植物体内，病毒含量一般较低，且由于所含多酚类物质容易氧化而影响提纯效果，因此，在可转接至草本寄主的情况下，多选用草本植物为繁殖寄主。
病毒提纯方法很多，应针对不同病毒的特性和繁殖寄主植物的特点选择合适的提纯方法。一般而言，植物病毒提纯的主要步骤包括粗提液的制备、差速离心、分步沉淀和梯度离心。粗提液的制备方法是将带病毒的植物材料在一定的缓冲液中捣碎，经4层纱布过滤后获得含病毒的滤液。差速离心就是将病毒粗提液，经交替进行低速和高速离心，使病毒和寄主成分分离。分步沉淀是采用一定浓度的化学物质，如硫酸铵、聚乙二醇（PEG）等，使病毒沉淀，然后用较小体积的缓冲液悬浮病毒，达到去除杂质和浓缩病毒的目的。有时为得到高纯度的病毒制品，对经分步沉淀和差速离心浓缩获得的病毒溶液，还须通过梯度离心进一步纯化，常用的有蔗糖密度梯度和硫酸铯或氯化铯平衡梯度离心。梯度离心后收集含病毒的溶液，经缓冲液透析或超速离心获得纯化病毒。
近年来，随着分子生物学中基因克隆技术的普遍应用，大多数已知植物病毒基因组的全序列或部分序列已经测定，这样可以根据已知序列设计合成引物，克隆植物病毒的外壳蛋白基因，并在大肠杆菌中表达病毒的外壳蛋白，经进一步纯化的外壳蛋白可以作为抗原免疫动物获得特异的抗体。这为目前还无法提纯或提纯较困难的病毒血清学研究提供了一条有用的途径。
②植物病毒抗血清制备病毒抗血清是将纯化的病毒免疫注射动物而获得的。常用动物为家兔，一般选用半周岁左右、健康、自然抗体阴性的日本大耳兔和半耳垂家兔，雄性较易产生抗体。免疫途径有多种，如腹腔注射、静脉注射、肌肉注射、皮下注射、皮内注射，也可采用四肢足掌等注射方法。在进行肌肉、皮下或皮内注射时，常加入佐剂乳化抗原，一般用福氏佐剂。在免疫期间可以不断从耳静脉取血测定抗血清的滴度，达到要求滴度后即停止注射，大量采血。具体选用哪种免疫注射途径，常无固定方案，因操作者的经验和偏好而异。采血的主要方法有静脉采血、颈动脉采血和心脏采血等。所用器皿需经严格消毒，采血前试验兔要给水、停食24h，这样可以减少血液中的脂类，得到清亮的血清。耳静脉采血可以连续采血多次，每次间隔3～5d，采血期间发现抗血清滴度下降，可注射适量抗原，使抗血清滴度上升，继续采血。颈动脉采血和心脏采血，常在试验结束时采用，可以收集大量血清。将所收集的血液置37℃温箱1～2h下凝固后，用吸管沿容器壁将血凝块剥离，然后置4℃过夜，吸出溶液，4000r／min离心10min，上清液即为无红细胞的清亮抗血清。所获抗血清按0.02％～0.19％的量加入硫酸汞或0.01％的量加入叠氮化钠（NaN2）防腐，也可以加入等量甘油，无菌分装后，密封-20℃冷藏备用。
采用以上方法制备的抗血清含有多种抗体，这些抗体是由动物的多种淋巴细胞所产生的，因此也称为多克隆抗体（polyclonal antibody，Pab）。
③单克隆抗体制备技术单克隆抗体就是由免疫动物的单细胞系所产生的抗体。单克隆抗体技术是1975年由KOhler和Milstein首先建立的。它是继遗传工程技术后生物技术方面的一项重要突破，当时被誉为生物学上的一项革命性新技术。该技术一经建立就引起人们的极大兴趣和高度重视，在微生物学、医学及免疫学等多个学科得到广泛的应用。KOhler和Milstein也因此于1984获得诺贝尔生理学-医学奖。
单克隆抗体的制备包括以下步骤：
a.免疫注射用病毒抗原免疫注射实验用小白鼠（BALB／C，一般采用腹腔注射的方法，注射3～4次。
b.细胞融合取免疫小白鼠的分离脾细胞，与不产生抗体的骨髓瘤细胞进行共培养，使两者融合，获得杂交瘤细胞。
c.克隆化采用稀释法，取单细胞在培养板中进行培养。一般克隆2～3次。
d.筛选采用血清学方法，用已知的抗原对单细胞培养液中的抗体进行检测，保留抗体分泌阳性的单细胞系。该细胞系即为能分泌一种特异抗体的杂交瘤细胞株，它既具有免疫的脾细胞分泌抗体的特性，同时兼具骨髓瘤细胞可大量繁殖的特点，且单个克隆细胞分泌的抗体完全一致。
e.抗体生产可采用两种方法。一种方法是用一定浓度的杂交瘤细胞注射小白鼠腹腔，使其产生含抗体的腹水。另一种方法是，将所获的杂交瘤细胞株在盛有培养液的培养瓶中进行培养，获得含单克隆抗体的培养液。前种方法所获抗体溶液较少，但效价较高；后者可获得大量抗体溶液，但效价相对较低。
与常规的抗体制备技术相比，单克隆抗体制备技术具有较多的优点：①所需抗原量较少，也不要求高纯度的抗原，免疫一只小白鼠仅需约0.2mg的抗原，而免疫一只白兔往往需要2～5mg的抗原。②在克隆化的过程中直接筛选能分泌特异抗体的单细胞，避免了寄主的非病毒性抗原的干扰，使血清学检测的特异性得到明显加强。③一旦获得能分泌抗体的杂交瘤细胞株，即可在液氮中长期保存，并根据需要随时生产单克隆抗体。因此，理论上可以无限量地生产抗体，不需要再进行病毒的繁殖、提纯和免疫。④由于不同的杂交瘤细胞株所分泌的抗体可针对不同的抗原决定簇，因而对病毒株系的鉴别具有重要意义。
目前有许多公司可提供用于植物病原病毒检测的单克隆抗体、多克隆抗体及血清学检测试剂盒，如Agdia（Elkhart，Ind.）、Bioreba（Switzerlan）、Adgen（Ayr，UK）和Agritest（Valenzano，Italy）及西班牙的Ingenasa（Madrid）和Durviz（Valencia）。
（2）常用血清学检测方法
可用于植物病毒检测和鉴定的血清学方法很多，包括沉淀反应、凝聚反应、免疫电镜和酶联免疫吸附技术等。检测技术是逐步向自动化、标准化、定量化和快速灵敏的方向发展。早期应用较多的是沉淀反应，包括试管沉淀、玻片沉淀、毛细管沉淀和免疫双扩散等，这些方法主要是通过观察病毒和相应的抗体形成网状复合物产生的沉淀反应，而作出判断，其中琼脂免疫双扩散技术早期在抗体效价测定和病毒血清学关系测定中应用较多，根据产生的沉淀线交叉类型可以鉴别病毒血清学关系的远近。免疫电镜和酶联免疫吸附技术（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）是较新近发展起来的血清学检测技术，具有灵敏度高的特点，且采用ELISA技术可在短时间内对大量样品进行检测，如在西班牙1997-2003年采用ELISA技术检测的柑橘速衰病毒（Citrus tristeza，CTV）样品次数达300万次。这些技术已在植物病毒的鉴定、定量和定位分析中得到广泛的应用。
①凝胶双扩散反应（Gel diffusion）是在半固体的琼脂糖凝胶中测定抗原和抗体之间的沉淀反应。抗原和抗体在凝胶中自由扩散而形成一定的梯度，当二者比例合适时产生清晰的沉淀带。此外，由于不同的抗原扩散速率不同而形成沉淀的位置也不同，因此凝胶扩散可以鉴别混合抗原和评价抗原的关系。其操作方法如下：
a.将培养皿置一平面上，倒人熔化的琼脂或琼脂糖（用0.85％ NaCl配置成0.7％～1.5％的浓度），约3mm厚，室温下凝固后，放人塑料袋中，置4℃保存。
b.在平板上打孔，中央一孔，周围一圈6～8孔均匀分布。中央孔为抗体加样孔，周围孔为待测抗原和已知对照抗原加样孔，这些孔与中央孔边缘的距离为4～5mm，各孔的直径一般为2～4mm。
c.在各孔中按设计要求分别加入抗体或抗原制备液，加盖后将培养皿置室温或4℃下，直至沉淀线形成。
一般在加样后3h即有反应发生，但需12～14h后才能产生沉淀线。如果所有测试孔均形成相同的带型，则表明这些抗原完全相同（图7-7）；相邻两条沉淀带相交叉，说明这两种抗原不同；相邻两条沉淀带局部交叉，形成一“刺突”（spur），则表明这两抗原不同，但血清学相关。
②免疫电镜技术（immunoelectron microscopy，IEM）是将抗原与抗体的专化性免疫反应与电镜观察相结合的一种病毒检测方法。染色前病毒能被特异的抗体修饰，这样当同一寄主植物有多种粒子形态、大小相近的病毒存在时，可通过抗体对病毒粒子的特异修饰作用鉴定病毒种类（图7-8）。其操作简便、结果判断直观。具体操作步骤如下：
a.抗原吸附在铜网覆有薄膜的一面滴一滴待检样品粗提液或将铜网覆有薄膜的一面扣在一滴样品粗提液上，静置约5min，然后用蒸馏水约20滴轻轻冲洗，保留吸附到铜网上的病毒粒子。
b.免疫修饰将吸附有病毒的铜网扣在一滴已知的待检病毒抗体溶液上，抗体的稀释度根据其效价而定，保持约30min，使抗体与病毒抗原结合，然后用蒸馏水约20滴轻轻冲洗，去除未结合的抗体。
图7-6
图7-7
c.染色常用的负染剂有2％磷钨酸钠或钾盐（PTA，pH值为7）和2％乙酸铀（UA，pH值为4.2）。其中UA应用较广，当染色适当时可产生高的对比度，对多数病毒的细微结构有较好的保护作用。用UA的染色时间为1～2min，染色完毕立即用滤纸吸尽残留液。
d.观察在透射电镜下观察，待检病毒粒子外可见一明显的抗体修饰层。
当病毒浓度较低时，在吸附抗原前，先用一定浓度的抗体包被铜网，这样铜网上的抗体可对病毒起到诱捕作用，从而可提高检测效果，这种方法也称为免疫吸附电镜法（immuno-sorbent electronic microscopy，ISEM）。免疫电镜技术适合于小量样品的检测，当有大量样品需检测时，这种方法不适合，同时该技术所需仪器昂贵，使其应用受到一定的限制。
③酶联免疫吸附分析（enzyme-1inked Immuno-Sorbent Assay，ELISA）1976年Voller和C1ark首次将酶联免疫吸附分析用于植物病毒的检测，并已得到广泛应用。该项技术把抗原与抗体的特异性免疫反应与酶的高效催化作用有机地结合起来，通过酶的放大作用而显著提高检测灵敏度。它具有快速、简便、准确等优点，不需要提纯病毒，可在较短时间内检测大量样品，是目前应用最广泛的血清学技术。
根据所采用的酶标抗体不同，ELISA可分为直接法和间接法。直接法即所用酶标抗体为病毒特异抗体，因此针对不同病毒的抗体需分别进行标记；间接法所用酶标抗体为通用的市售抗体，如羊抗兔酶标抗体、羊抗鼠酶标抗体等，因此无需对每一抗体进行标记。常用的标记酶有辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸酯酶（AP），其底物分别为邻苯二胺和对硝基酚磷酸；固相支持物通常为以聚苯乙烯为原料的多孔微量板。
目前可用于植物病毒检测的ELISA法很多，以下就常用的方法简要介绍如下：
a.双抗体夹心法（double antibody sandwich ELISA，DAS-ELISA）是一种直接法。首先用病毒特异性抗体（IgG）包被微板孔，然后加入待检样品粗提液，使包被的抗体捕捉样品中的病毒粒子，再加入酶标抗体，最后加入底物，室温避光放置一定时间后，判断结果（图7-13）。
图7-8
b.三抗体夹心法（triple antibody sandwich ELISA，TAS-ELISA）第一步进行包被的方法与DAS-ELISA相同，但第二抗体为与包被抗体不同的来源于另一种动物（如小白鼠、鸡等）的特异抗体，然后加入与第二抗体特异的酶结合抗体，如当二抗为小白鼠单克隆抗体时，可用羊抗鼠或兔抗鼠酶标抗体。最后加入底物，室温避光放置一定时间后，判断结果。
c.A蛋白酶联免疫吸附法（protein A sandwich ELISA，PAS-ELISA）为一种间接法。首先用A蛋白包被微板孔，然后加入病毒的抗体，再加入待检样品粗提液，经第二层抗体与病毒结合，加人酶标记A蛋白，最后加入底物，室温避光放置一定时间后，判断结果。
在以上操作流程中每次加样后都必须在37℃孵育2h或4℃过夜。除第一步外，每次加样前要倒掉微孔中的溶液，用PBST洗涤3～4次，每次5min。在进行病毒的大量检测时，先要对每一试剂的适宜工作浓度进行选择，抗体的工作浓度因其来源和批次不同而有差异。病毒提取缓冲液的选择常因寄主种类的不同而异，常用的有0.02mol/L、pH值为7.4的磷酸盐缓冲液（PBS）和0.02mol/L、pH值为8.3的Tris-HCl缓冲液，必要时添加一些成分，如抗氧化剂巯基乙醇和铜试剂（DIECA）等，以及牛血清白蛋白（BSA）和聚乙烯吡咯烷酮（PVP）等。
结果的观察和判断可采用目测法和用酶标仪测定。目测法是根据待检样品与阴性对照的最终颜色反应差异判断。酶标仪测定反应后的底物溶液在一定波长下的吸光值，当待检样品吸光值／阴性对照吸光值≥2时，视为阳性反应。
ELISA技术由于其具有较高灵敏度，被广泛用于植物病毒检测，可检测的植物组织包括叶片、枝条、花瓣、果实、根系等。此外，该技术还用于分析某些植物的单个种子和病毒介体昆虫（蚜虫、飞虱）的带病毒状况。
④组织免疫杂交分析（tissuse blotting immuno assay，TBIA）该分析也称组织免疫印迹ELISA（tissue printing ELISA）分析，其原理与ELISA相同。所不同的是用一种特殊的薄膜代替常规的微量板作固相支持物，酶催化底物反应产生的是不溶性的有色物质沉积在带病毒的部位，观察有色物质即可判断是否带有病毒。通过组织切面在膜上产生印迹，将抗原直接束缚在膜上，不需要制备或提取样品，而且可直接提供病毒在组织中的分布信息，尤其适合于韧皮部限制性病毒的检测，具有灵敏度高、结果可靠和快速的特点。该项技术已成功应用于柑橘速衰病毒（CTV）等的大规模检测，并成为欧共体国家官方推荐的CTV检测方法。下面以CTV为例简要介绍其操作步骤：
a.剪取大小合适的PVDF膜，经100％甲醇平衡10min和蒸馏水漂洗5min后备用。
b.取待检植株的嫩枝条，用刀片切一新鲜的切口（纵向或横向），立即在膜上轻压印迹，每样品重复2次，检测部位也可以是叶片和叶柄。
c.印迹后的膜经室温干燥固定10min后，放入培养皿中加5％的脱脂奶（用PBS溶解），室温下振荡1～2h，封闭膜上未结合位点。
d.在封闭液中加入合适工作浓度的CTV特异性多克隆抗体，室温反应2h或4℃过夜。PBST洗涤3次，每次3～5min。
e.将膜移入含AP-羊抗兔IgG的PBST稀释液中，室温孵育2h，然后用PBST洗涤，方法同上。
f.加入底物溶液（NBT/BCIP），NBT和BCIP最终质量浓度分别为0.33mg/ml和0.175mg/ml，印迹薄膜放在底物溶液，显色后用蒸馏水冲洗以终止反应，肉眼或在放大镜下观察，判断结果。带病毒部位为深紫色，而无病毒样品或部位无紫色反应。
近些年来，越来越多的转基因抗病毒植物问世，其中大部分来源于病毒本身的序列介导的抗性，病毒外壳蛋白基因在转化植物中的表达可干扰血清学检测效果，因为目前用于病毒检测的单克隆或多克隆抗体绝大多数是针对完整的病毒粒子或外壳蛋白基因体外表达蛋白F覃决定簇的。在这种情况下，采用血清学技术进行检测时可利用针对非结构蛋白（如运动蛋白、辅助蛋白等）制备的抗体或用其他替代方法。
g.ELISA及TBIA检测常用缓冲液及其配置
包被缓冲液0.05mol/L、pH值为9.6的碳酸缓冲液。
加蒸馏水至1000ml。
洗涤缓冲液PBST（0.02mol/L、pH值为7.4 PBS+0.05％Tween-20）
加蒸馏水定容至1000ml，然后加Tween-20 0.5ml。
样品提取缓冲液PBST+0.2％PVP+0.1％牛血清蛋白（BSA），pH值为7.4。
碱性磷酸酯酶底物缓冲液
二乙醇胺 97ml
用2mol/LHCl调节pH值至9.8，加蒸馏水定容至1000ml。NBT／BCIP底物缓冲液
用2mol/LHCl调节pH值至9.5，加蒸馏水定容至100ml。
⑤电泳分析这种方法在类病毒的检测中应用广泛，各种类病毒均可采用该方法进行分析。类病毒为环状单链RNA分子，大小为246～375个核苷酸（nt），内部碱基高度互补。在自然情况下形成棒状或三叶草状的二级结构，在常规电泳条件下迁移较快；在变性条件下，由于二级结构破坏而成环状，在电泳介质中迁移减缓而与其他小分子物质分开，表现类病毒的特有电泳条带。因此双向电泳也是鉴别一种病原是否为类病毒的常用技术。
类病毒的电泳检测主要包括两个环节，即核酸提取和电泳分析。
a.核酸提取一般用待检样品总核酸粗提液即可，常用提取缓冲液为pH值为8.0的Tris-HCl，附加十二烷基硫酸钠（SDS）和PVP等。提取步骤为：取一定量的待检样品，加入2～5倍体积的提取缓冲液和等体积的苯酚/氯仿，捣碎、离心后，取上清液，加3倍体积的乙醇沉淀核酸，沉淀物经75％乙醇洗涤一次后，适当干燥，然后溶于少量蒸馏水中。
b.电泳常用的电泳方法有单向电泳和双向电泳两种。单向电泳一般采用5％聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE），当溴酚蓝到达胶的底部时，用硝酸银或溴化乙锭染色，用已知类病毒作对照，观察类病毒条带。双向电泳包括垂直双向电泳和往复式电泳。单向采用常规的5％聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE），当指示剂二甲苯青FF到达凝胶中部时，停止电泳，切下近二甲苯青FF的1～2cm宽的凝胶。平行（往复式电泳）或旋转90°（垂直双向电泳）后放在玻板的底部。安装玻板后重新灌胶，双向电泳凝胶为含8mol／L尿素的5％变性PAGE，电泳时先将电泳缓冲液加热至80℃左右，倒入槽中保温约10min使类病毒充分变性，然后改变电极方向，电泳一定时间后，切断电源，取出凝胶，硝酸银染色，观察有无类病毒条带。
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