第七节分子检测技术及其在植物检疫检验

第七节　分子检测技术及其在植物检疫检验 中的应用

在植物检疫中，为减少病害发生的风险和阻止病原物的传播，对许多病原物，尤其是种苗传播的某些病原物要求零允许，这样就要求检验技术向特异性强、灵敏度高和快速的方向发展，即能在较短的时间内获得对微量的病原物的准确检验结果。分子检测技术主要是基于核酸杂交和扩增来达到对特定病原物或其他目标生物检测的目的。随着分子生物学技术的发展，许多分子技术已应用于各类生物的检测和鉴定，其中应用最广泛的是PCR技术。此外，还包括常规杂交和生物芯片在内的各种核酸杂交技术、分子标记技术等也在一定的程度上得到应用。

各种分子检测技术主要是依据目标生物的特定核苷酸序列而设计的，因此对各类目标生物的基因组序列的测定也促进了这些分子技术在目标生物检测中的应用。在植物有害生物中，病原物相对较小，采用常规的检测技术有时不能达到理想的效果。同时由于病原物，尤其是病毒和类病毒的基因组相对较小、测序较容易，使分子检测技术得以广泛而有效的应用。目前绝大多数植物病毒和类病毒的全基因组或部分基因组核苷酸序列已经明确，截至2003年已测定全基因组序列的植物病原病毒有近50种。植物病原细菌的基因组相对植物病毒而言要复杂得多，有关的基因组测序和基因功能研究也相对缓慢。至2003年，世界各国发布了全基因组序列的细菌共有108个，其中仅有4个为植物病原细菌；114个正在测序的细菌中，仅6个为植物病原细菌。这些病原物的基因或基因组序列可通过NCBI从GenBank（www. ncbi.nlm.nih.gov/Entrez/）和其他数据库中查阅。

一、PCR技术

聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）是一种体外选择性扩增特定DNA片段的核酸合成技术。其基本原理是在模板及引物存在和适宜的温度条件下，DNA聚合酶可以催化单个脱氧核苷酸（dNTP）从引物的3’-OH引入，并沿模板DNA的5’→3’方向延伸，合成与模板互补的DNA链。其反应的基本步骤包括：首先模板DNA在高温（92～95℃）条件下进行变性，双链解开成两条单链；然后，在较低的退火温度（40～60℃）下，引物与模板DNA序列互补段特异性结合，形成部分双链结构（即退火）；再在72℃条件下，DNA聚合酶介导由模板5’→3’方向的DNA链延伸，形成互补双链。如此，经过变性、退火、延伸反复循环，目的基因每次循环的产物都可成为下一次扩增的模板，因而PCR产物量以指数方式递增，经过约25～30个循环后，模板DNA的量可被扩增10⁶～10⁷倍。PCR技术的建立是生物技术发展史上的重大变革，Mullis等也因此发明于1993获得诺贝尔奖。由于其特异性强、操作简便、且灵敏度高等特点，在基因的扩增、重组及分子生物学的各个领域中得到广泛应用。同时也在各类病原物的鉴定和检验中发挥了重要的作用，在植物检疫中，已作为植物有害生物检疫检验的常规技术，尤其对那些个体微小、检验难度和技术要求相对较高的病原物的检验，其技术优势更显突出。

1.PCR技术的改进

植物病原物的PCR分析一般包括模板DNA或RNA的获得、PCR扩增和扩增结果的分析等几个环节。在各类PCR检测技术中，除PCR本身的反应体系外，提取的DNA或RNA模板的质量是影响分析结果的关键因子之一。早期采取的提取方法极其复杂，且由于寄主植物成分的氧化以及在寄主植物中存在很多对DNA聚合酶具有抑制作用的物质可严重影响检测效果。随着研究的深入，DNA或RNA提取方法已逐步简化，而且有商品化的核酸提取试剂盒出售，使操作更加简便化。如德国的RNeasy和DNeasyP1ant System（Qiagen，Hilden）及美国的Easy-DNA-Extraction kit（Invitrogen，Carlsbad，California，USA）等已成功用于不同类型植物材料DNA或RNA提取。

近些年来，PCR技术也在不断改进，在常规PCR基础上开发出多种满足各种不同需求的PCR技术，包括适合于RNA分析的反转录PCR（RT-PCR）、可同时检测多种目标序列的多重PCR（multiple PCR）、灵敏度更高的巢式PCR（nested PCR）和可以定量分析的实时荧光定量PCR（real time fluorescent quantitative PCR）等。随着生物技术的发展和研究的不断深入，还会开发出更多的新方法，其总的趋势是向着更加灵敏、简便、高效、多通道和定量化的方向发展。

在这些PCR技术中，除实时荧光定量PCR外，对扩增产物的分析通常是采用电泳的方法，即通过一定浓度的琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳后，用溴化乙锭或硝酸银染色，观察目标条带的有无作出判断。也有人采用分子杂交的方法，用地高辛或生物素标记探针与PCR产物杂交，然后通过酶标记抗体与地高辛或生物素特异结合，酶催化底物产生有色物质，由于抗体的放大作用，可提高分析的灵敏度，这种方法是将PCR技术与酶联免疫吸附反应相结合，因此也称为PCR-ELISA。

2.常用PCR技术及其在植物检疫中的应用

（1）RT-PCR及IC-RT-PCR这两种方法是植物病毒检测中应用最广泛的分子技术。病毒根据其基因组核酸类型的不同可以分为两大类，即DNA病毒和RNA病毒，引起植物病害的病毒大部分为RNA病毒，类病毒为环状的RNA分子。由于在PCR中所使用的酶为依赖于DNA的DNA聚合酶，常用的为耐高温的Taq DNA聚合酶，该酶以DNA为模板介导互补DNA（cDNA）的合成。对于基因组为RNA的病毒和类病毒，必须在反转录酶的作用下以RNA为模板合成互补DNA（cDNA）才能进行PCR，因此常规的RNA病毒的PCR检测也称反转录PCR检测技术（RT-PCR）。

RT-PCR技术自开创以来，在植物病毒的检测中发挥了重要作用。该项技术的关键是获得病毒基因组核酸，按照常规的方法提取核酸，不仅操作繁琐，有时因寄主植物成分的氧化和存在对酶具有抑制作用的物质而严重影响检测效果，特别是RNA病毒基因组核酸很易被RNA酶（RNase）降解，对操作要求十分严格。因此，许多植物病毒工作者在不断探索更加简便、灵敏、快速的PCR检测技术，其中一个重要的改进就是将病毒的抗原与抗体特异性免疫反应与PCR技术相结合（也称免疫捕捉RT-PCR，即Imunocapture-reverse tran-scription PCR，IC-RT-PCR）。IC-RT-PCR的操作方法与常规RT-PCR类似，所不同的是先在PCR管中加入一定稀释度的病毒特异抗体，然后加入待检样品粗提液，使病毒与抗体特异性结合，再经洗涤除去未结合的物质，加入裂解液释放病毒核酸后，即可取少量裂解液进行反转录。因此，这项技术不仅可避免常规核酸提取过程中酚类物质对人体的不良影响，同时结合了免疫反应特异性强和具有浓缩病毒作用的优点，使检测的特异性更强、灵敏度更高。此外，在无病毒特异抗体的情况下，有人利用ELISA分析微孔板或PCR管的孔壁或管壁具有吸附蛋白或核蛋白等大分子物质的特性，通过微孔板或PCR管捕捉病毒，然后进行PCR扩增获得了较好的结果，这种方法也称试管捕捉PCR（DNA病毒）或试管捕捉RT-PCR（RNA病毒）。其操作过程中除捕捉病毒方式不同外，其他步骤与IC-RT-PCR相同。

以检测苹果褪绿叶斑病毒（ACLSV）为例，IC-RT-PCR操作步骤如下：

①包被多克隆抗体。用碳酸包被缓冲液稀释抗体至适当浓度，每管200μL，37℃下孵育2h，用PBST洗涤3次，每次2min；

②加入200μL样品，4℃过夜，PBST洗涤5次，每次2min；

③加入25μL转移缓冲液（0.02mol/L Tris.Cl+1％Triton，65℃预热），65℃水浴5min；

④加入10pmol互补引物或100mmol／L随机引物1.5μL，煮沸5min，冰上冷却3min，加入6μL的5×反转录缓冲液（RT Buffer），室温30min，取15μL加入到另一PCR管中，加入如下10μL反转录混合液，42℃孵育1h，沸水3min，4℃备用。

⑤以cDNA为模板进行PCR扩增，25μL体系，各溶液和试剂用量如下：

ACLSV扩增条件为96℃变性5min，然后94℃，20s；54℃，30s；72℃，45s，共30个循环。

⑥PCR产物的电泳分析。1.5％琼脂糖凝胶电泳，160V下电泳1h后，溴化乙锭染色20min，经BIO-RAD公司的凝胶成像系统观察病毒特异性扩增条带（图7-10）。

如前所述，植物类病毒为环状单链RNA分子，目前很多类病毒RNA序列测定已经完成，因此可以根据已知序列设计引物，采用上述RT-PCR进行检测，这种方法在各种类病毒的检测中也有广泛应用（图7-11）。

在松材线虫的检疫检验中，采用常规的分离方法，经常可分离到拟松材线虫，二者形态极相似，较难区分，容易混淆。且在线虫的形态鉴定中一般是以成虫形态为依据的，幼虫不具备形态鉴定特征，而在木质包装中所截获的线虫经常为幼虫。为提高检测的灵敏度和特异性，克服常规检验技术的不足，有关研究者对该线虫的PCR检测技术进行了研究。根据已报道的松材线虫和拟松材线虫的rDNA部分序列设计特异性引物，通过PCR能成功区分这两种线虫，可实现对单条线虫幼虫的检测。我国赵立荣等在rDNA的ITSl区设计合成了一条松材线虫的特异引物，在18S、5.8S及28S区设计了三条松材线虫和拟松材线虫的通用引物，实现了对松材线虫、伞滑刃线虫的检测，而且还可以区分滑刃线虫和真滑刃线虫。

图7-10

图7-11

（2）巢式PCR（Nested-PCR）采用两对特异引物进行两次扩增，其中第二对引物位于第一对引物的内侧。第二次扩增是以第一次扩增产物为模板在第二对引物的介导下进行的，因此最终扩增产物的大小由内侧引物所决定。与常规PCR相比，巢式PCR的检测特异性和灵敏度都有明显的提高。该技术在植物病毒和细菌等的检测中都有广泛的应用。柑橘黄龙病（citrus huanglong）是一种在柑橘生产上危害极其严重的细菌性病害。由于其病原一直难以进行人工培养，使得对该病害的研究受到了很大的限制。近年来许多人将PCR技术成功用于该病原物的检测。在我国，田亚南等首次报道运用PCR技术对该病病原进行检测，李韬等首次运用Nested-PCR对该病原的自然传播介体柑橘木虱及其寄主九里香的带菌率进行了研究。丁芳等（2004）采用PCR和Nested-PCR技术对柑橘黄龙病进行检测，对特异的柑橘黄龙病的DNA片段进行了克隆、测序分析，并对两种方法检测柑橘黄龙病菌的灵敏度进行了比较。结果证明Nested-PCR比常规PCR的灵敏度更高，常规PCR所能检测到的最低DNA的量为皮克（pg）数量级，而Nested-PCR所能检测到的DNA浓度低于飞克（fg）数量级，其灵敏度约为常规PCR的l0⁴倍。

（3）共作PCR（co-operational PCR，co-PCR）这是Olmos（2002）新近报道的一种PCR技术，该技术已申请西班牙专利保护（西班牙专利P20002613；2000年10月31日）。该技术是在一个反应体系中3个或4个引物同时作用，反应过程包括同一目标的两个不同片段（一个片段位于另一片段内）同时反转录，产生4个扩增子，与nested-PCR相反，co-PCR中扩增子的共同作用，可产生大的扩增片段。

co-PCR技术已成功应用于植物RNA病毒的检测，如樱桃卷叶病毒（Cherry leaf rolluirus，CLRV）、草莓潜隐环斑病毒（Strawberry latent ringspot virus，SLRSV）、黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus，CMV）、李痘病毒（Plum pox virus，PPV）、柑橘速衰病毒（Citrus tristeza virus，CTV）和劳尔青枯杆菌（Ralstonia solanacearum）。其灵敏度可达RT-PCR的100倍，与巢式PCR相当，而且该技术仅需一次PCR反应，因此可以减少操作过程造成的污染，也可节省检测所需试剂。

（4）多重PCR（multiplex PCR）在同一反应体系中采用多对特异性引物进行扩增，因不同引物的扩增片段长度不同，可通过电泳进行鉴别，因此在一个反应体系可同时检测不同的目标DNA或RNA。Bertolini等（2001）采用多重PCR同时检测橄榄上的4个不同属的6种病毒（CMV、CLRV、SLRSV、ARMV、OLV-1和OLV-2）。在此基础上，Bertolini等于2003年又报道了将多重PCR与巢式PCR相结合的多重嵌套式RT-PCR（multiplexnested RT-PCR），可成功地同时检测橄榄上的4种病毒CMV、CLRV、SLRSV和ARMV及一种引起油橄榄肿瘤的病原细菌（Pseudomonas savastanoipv.savastanoi）。该技术结合了多重PCR与巢式PCR的优点，可实现同时对多个病毒和细菌的检测，且灵敏度高、结果稳定，其灵敏度较多重PCR至少可提高100倍，同时可节省时间和试剂。采用该技术可以快速鉴别一种植物是否受到多种病毒或细菌等的侵染，也为健康植物材料的检验提供有效的快速灵敏的手段。

（5）实时荧光PCR（real-time or quantitative PCR）也称同步

PCR，是通过特殊的仪器对反应的监控、荧光探针与扩增子的结合、检测和定量分析一步完成。借助于荧光信号来检测PCR产物，一方面提高了灵敏度，另一方面PCR每循环一次就收集一个数据，建立实时扩增曲线，准确地确定值，从而根据ct值确定起始DNA拷贝数，做到了真正意义上的DNA定量。其主要过程包括设定反应体系、热循环及全程的实时监控，最快在20min内给出结果。

实时荧光PCR是利用荧光对核酸分子检测，常用的有SYBR Green I荧光染料和杂交探针。目前商品化的杂交探针很多，包括TaqMan探针、分子信标（molecular beacons）等。比较而言，探针杂交技术在原理上更为严格，所得数据更为精确；荧光染料技术则成本更为低廉，试验设计更为简便。

①TaqMan探针（Applied Biosystems，Foster City，California，USA）由单链的寡核苷酸组成，一个荧光报告基团（reporter，R）与其5’端结合，在3’端有一荧光淬灭分子（quencher，Q）。实时荧光PCR技术中Taq-Man探针作用的核心是利用Taq酶的3’-5’外切核酸酶活性，切断探针，产生荧光信号。由于探针与模板是特异性结合，所以荧光信号的强弱就代表了模板的数量。探针与模板特异性结合位点在两条引物之间。当探针完整的时候，荧光染料分子所发射的荧光能量被淬灭基团吸收，仪器检测不到信号。随着PCR的进行，Taq酶在链延伸过程中遇到与模板结合的探针，其3’-5’外切核酸酶活性就会将探针切断，报告基团远离淬灭基团，其能量不能被吸收，即产生荧光信号。所以，每经过一个PCR循环，荧光信号也和目的片段一样，有一个同步指数增长的过程。信号的强度就代表了模板DNA的拷贝数。

②分子信标（moleeular beacons）是一种在靶DNA不存在时形成茎环结构的双标记寡核苷酸探针。在此发夹结构中，位于分子一端的荧光基团与分子另一端的淬灭基团靠近。分子信标的茎环结构中，环一般为15～30个核苷酸（nt）长，并与目标序列互补；茎一般5～7个核苷酸长，并相互配对形成茎的结构。荧光基团连接在茎臂的一端，而淬灭基团连接于另一端。通过精心设计分子信标和优化反应条件（温度和缓冲液）后，其灵敏度非常高，可用于单核苷酸多态性（SNP）的检测。但是，在检测某一特定的目标DNA时，每一个探针都必须单独地进行设计。

③SYBR Green I是一种只与DNA双链结合的荧光染料。当荧光染料与DNA双链结合时可发出荧光，因此在一个反应体系内，其荧光信号强度代表了双链DNA分子的数量。SYBRGreen I的最大吸收波长约为497nm，发射波长最大约为520nm。该荧光染料能与所有的DNA双链相结合，对DNA模板没有选择性，所以特异性不如TaqMan探针。

实时荧光PCR技术因其高灵敏度和可定量分析的特点，在植物检疫中显示出良好的应用前景。我国朱建裕等（2003）根据已报道的番茄环斑病毒（TRSV）序列设计合成一对特异引物和一条TaqMan探针，建立了该病毒的实时荧光PCR检测方法。采用该技术检测大豆疫病病原真菌，可以实现对单个孢子的检测。

为了解决水果中携带实蝇检疫鉴定时间长的难题，深圳检验检疫局动植物中心植检实验室以国内外植物检疫普遍关注的地中海实蝇和我国口岸检疫截获频次最高的9种果实蝇为研究对象，开展了《检疫性实蝇常规PCR和SY、BR Green实时荧光PCR快速检测方法的建立及其推广应用》的研究，通过筛选分子标记基因，测定了橘小实蝇（Bactrocera dorsalis）、木瓜实蝇（B.papayae）、杨桃实蝇（B.carambolae）、菲律宾实蝇（B.philippinensis）、芒果实蝇（B.occipitalis）、辣椒实蝇（B. latifrons）、番石榴实蝇（B.correcta）、南瓜实蝇（B.tau）和瓜实蝇（B.cucurbitae）等25种检疫性实蝇mtDNA 28条COJ基因序列，自行设计、筛选出能特异区分地中海实蝇、橘小实蝇、木瓜实蝇、杨桃实蝇、菲律宾实蝇、芒果实蝇、辣椒实蝇、番石榴实蝇、瓜实蝇和南瓜实蝇10种实蝇的引物13对，将SYBRGreen实时荧光PCR技术应用到实蝇种类鉴定和近似种区分；建立了常规PCR和SYBRGreen实时荧光PCR检测10种检疫性实蝇的方法。两种PCR方法能对实蝇成虫、幼虫和蛹进行快速检测鉴定，鉴定周期从传统形态鉴定所需的20d以上缩短到2d以内，解决了实蝇检测周期过长的实际问题，并已在深圳口岸进出境实蝇检疫鉴定中得到应用。

二、核酸杂交技术

两种不同来源的核酸链通过碱基配对形成双链的过程称为核酸杂交（nucleotide hybridization）。采用特定的方法对一已知核酸片段进行标记，就可利用已知的核酸片段检测待检样品中是否有与该片段互补的核酸，这种带有特定标记的核酸片段称为核酸探针（probe）。因此采用该项技术的前提条件是制备特异的核酸探针。

1.核酸探针的制备

制备核酸探针的第一步是获得目标核酸或其片段，这可以通过PCR特异扩增、克隆目标片段或直接提取病毒及类病毒基因组核酸获得。标记的方法也有多种，选择哪种方法取决于工作者的爱好和实验条件，常用的标记物有放射性标记（如32P）、非放射性的地高辛（Dig）和生物素（biotin）等。这些标记可以通过缺口平移、末端标记、随机引物或PCR扩增等方式整合到核苷酸探针的序列中。此外，采用光敏生物素（photobiotin）标记只需在一定条件下光照约30min，然后经过纯化即可获得所需探针，简化了操作程序。依据标记的核酸不同，核酸探针可以是DNA或RNA探针，植物病毒及类病毒基因组多为RNA，所用探针多为互补DNA（cDNA）或互补RNA（cRNA）探针。

2.核酸杂交

杂交一般在固相杂交膜上进行，常用的膜有硝酸纤维素膜和尼龙膜，其中，尼龙膜具有操作容易且可使用多次的优点。采用一定的方法（如紫外线照射或碱处理）可使核酸与膜共价结合，从而避免在杂交过程中脱离杂交膜。杂交的方式有斑点杂交和核酸转移杂交。斑点杂交是将待检样品粗提液或核酸直接点于膜上，而核酸转移杂交是先将待检样品的核酸用限制性内切酶切为不同大小的片段，经琼脂糖凝胶电泳分离后，转移至膜上。点样的膜经一定波长的紫外线短时间照射（可在紫外线交联仪中进行）固定后，即可进行杂交。杂交的过程包括预杂交和杂交，预杂交的目的是封闭杂交膜上未与样品结合的活性位点，降低探针与膜的非特异性结合。杂交通常在变性条件下进行，先使核酸完全解链为单链，再与探针分子充分杂交。当采用放射性标记时，杂交结果的检测可采用X射线胶片自动放射显影的方式，根据杂交信号的有无判断检测结果。非放射性标记的杂交结果检测可通过化学发光或化学显色的方式判断。杂交效果受探针浓度、类型（RNA或DNA）、温度、离子强度、pH值等因子的影响。

核酸杂交技术在近些年来最大的改进是使用非放射性检测系统，将生物素-11-UTP或地高辛标记UTP渗入探针中，然后通过链亲和素或抗地高辛抗体检测，或直接将生物素结合到探针上再通过链亲和素检测。地高辛标记dUTP是植物病原物检测中应用最广泛的非放射性标记，抗地高辛抗体的酶结合物与探针特异结合，然后通过底物发光或分解产生有色的沉淀物来判断反应结果。但通过酶分解底物产生有色的沉淀物进行结果的分析，有时会受植物粗提液中的有色物质干扰而影响结果的判断。目前已有许多生物制剂公司有非放射标记试剂盒出售。采用非放射标记探针可达到与32P标记相似的检测灵敏度，在许多植物病原物的检验中已用非放射标记代替以前常用的32P标记。

一般而言，核酸杂交的灵敏度与ELISA相似，但不同病毒和植物材料情况不一样，有时其灵敏度高于ELISA，也有的灵敏度略低于ELISA。目前许多木本植物病毒尚未建立血清学检测方法，在这种情况下核酸杂交是可优先选择的一条途径。

核酸杂交技术在植物病原物，尤其是基因组较小的类病毒和病毒，如在马铃薯纺锤块茎类病毒（PSTVd）、桃潜隐花叶类病毒（PLMVd）和柑橘裂皮类病毒（CEVd）等和多种果树病毒的检测中有广泛的应用。

此外，荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization，FISH）最近已应用于细菌的检测，该技术结合了显微观察的简便直观和杂交技术特异性强的优点，通过DNA探针与细菌核糖体中特异性区杂交达到检测的目的。该技术特别适宜于细菌病害的诊断，因为细菌的核糖体RNA既含有所有种共有的功能区，同时又具有不同种特异的序列。FISH仅需识别特异的序列，探针不仅可以与线性化RNA杂交，也可与具有三维结构的蛋白质或RNA杂交，FISH检测的灵敏度与PCR扩增技术相当，从理论上可检测单个细胞。高灵敏度与探针的高亲和性及选择性有关，同时该技术可保持微生物的完整性。

在转基因抗病毒植物的病毒检测中，核酸杂交技术同样存在与ELISA相似的问题。在转基因的植物中，来源于病毒的基因或一段核苷酸可能与探针互补，因此需要选用非转化序列作为探针。

3.DNA芯片技术

DNA芯片（DNA chip）也称基因芯片（gene chip）或DNA微阵（DNA microarray），是生物芯片的一种。生物芯片技术是随着“人类基因组计划”（human genome project，HGP）的进展而发展起来的，它是20世纪90年代中期以来影响最深远的重大科技进展之一。DNA芯片技术是生命科学与微电子学等学科相互交叉的一门高新技术，采用光导原位合成或微量点样等技术，将数以万计的DNA片断（探针）高密度有序地固定在固相支持物（玻片、硅片、聚丙烯酰胺凝胶）上，产生二维DNA探针阵列，阵列中的每个分子的序列及位置都是已知的，并且按预先设定好的序列点阵。这样可与标记样品中的靶分子进行杂交，通过特定仪器对杂交信号强度进行高效、快速地检测分析，从而对检测样品中的靶分子进行高效判断和定量。DNA芯片技术具有微型化及能够同时并行处理大规模信息的特点。由于常用硅芯片作为固相支持物，且在制备过程运用了计算机芯片的制备技术，所以称之为芯片技术。

DNA芯片的基本操作过程包括：①样品的制备，通常需对待检样品进行扩增和标记，常用标记有荧光色素Cy-3和Cy-4或生物素标记dNTP，生物素标记需用链亲和素偶联的荧光素等引导进一步的检测。这样合成的DNA片段即带有荧光标记。②分子杂交，要根据探针的类型和长度等选择和优化杂交条件。③检测结果分析，洗去未杂交的分子后通过软件对每个荧光信号的强弱进行分析。在激光的激发下，荧光分子发出的荧光强度与二者杂交程度相关，样品与探针严格配对的杂交分子，热力学稳定性高，产生的荧光强度最强；而完全不能杂交的，热力学稳定性低，产生的荧光强度最弱。一般来说荧光的强弱与样品中的靶分子数量呈正相关。

基因芯片主要用于测序、基因表达水平分析、基因诊断和药物筛选等方面。该项技术在口岸植物检疫中已用于有害生物的鉴定与检验。

4.限制性片段长度多态性

限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）技术是用已知的限制性内切酶消化目标DNA，通过电泳印迹，再用DNA探针杂交并放射自显影，从而可以检测到酶切后长度不同的与探针互补的DNA序列。这种酶切片段长度差异的产生是由于单个碱基的突变或DNA序列发生插入、缺失、倒位、易位等变异，而导致限制性内切酶酶切位点的增减。迄今已分离到500多种限制性内切酶，作为探针的DNA片段可以来自各种生物的基因组或核糖体DNA。RFLP的结果稳定，在作物基因图谱构建和QTL基因定位分析上使用较多。然而，RFLP技术DNA用量大、纯度要求高，且操作上环节多、周期长，需用放射性探针标记，对人体有一定的伤害，试验费用也较昂贵。这些都极大地限制了RFLP技术大范围的应用。

在植物有害生物的鉴定中，RFLP可用于植物病原物、害虫等的鉴别。如在原核生物的鉴定中，可通过用多种限制性内切酶对16SrDNA和23S rDNA的PCR产物进行酶解，然后电泳分析，通过电泳带谱区分不同的种类。我国李永等（2003）采用该技术，用5种限制性内切酶成功鉴别了引起枣疯病和泡桐丛枝病的植原体。此外，在柑橘速衰病毒研究中发现利用弱毒株系与强毒株系的交叉保护作用是一条有效的防治途径。因此在种苗的检疫检验中涉及对弱毒和强毒株系的鉴定，已有研究表明，采用RFLP技术在某些情况下可以鉴别弱毒株系。